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文獻分享 | 比較全掃描、DDA、DIA三種采集模式在非靶向代謝組學的差異

分類:公司動態   發布時間 2020-12-11   閱讀: 5837


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非靶向代謝組學正在成為一種強大而有吸引力的技術,已被廣泛應用于許多研究領域,全掃描(full-scan)、數據依賴采集(DDA)和數據非依賴采集(DIA)是基于高分辨質譜的非靶向代謝組學中的三種常見數據采集模式。全掃描是將代謝物一級和二級分開掃描、所需檢測時間較長。DDA中,質譜儀器進行全掃描,然后對從全掃描質譜中選擇的母離子(強度依賴)列表進行二級掃描。而理論上,DIA能夠對所有代謝物的MS2信息進行連續和無偏倚的采集。但由于其MS2質譜信息十分復雜,母離子和子離子關聯不緊密,數據處理存在困難。


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由于每種數據采集模式的獨特性和局限性,所以我們有理由相信數據采集模式的選擇可能會影響代謝組學結果的質量。作者使用標準品混合物和人尿分別在RP(+)和HILIC(-)中進行實驗。實驗結果表明全掃描模式能夠獲得最多的peak,其次是DIA和DDA。比較DIA和DDA中的MS2譜圖,DDA中的MS2譜圖的質量更高,DIA中MS2譜圖的數量更多。此外,相對標準偏差結果顯示,DDA在定量準確度上缺點不明顯,三種采集模式具有一致性。就數據預處理的便利性而言,DDA是三種方法中最方便的,它可以從peak提取到代謝物的鑒定實現完全自動化,并將基于全掃描的工作流程從天縮短到小時。在處理DIA數據時仍需要解決一些生物信息學問題,并且迫切需要開發更有效的計算程序。

結果

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圖1.比較非靶向代謝組學中全掃描,DDA和DIA模式的示意圖工作流程

全掃描(full-scan)、DDA和DIA綜合評估的工作流程示意圖如圖1所示。在這項研究中,研究人員測試了134種標準品混合物(StdMix)和1份尿液樣本(Urine)(原始濃度和100倍稀釋)。LC-MS分析在RP(+)和HILIC(-)中進行,收集數據后,對三種數據采集方式進行peak數量、定量精度、MS2質譜的數量和質量以及便利性等五方面進行比較。

表1.通過三種數據采集方法分析的標準混合物中確認的代謝物數量
* StdMix(L)中檢測到的代謝物與StdMix(H)中檢測到的代謝物及相應百分比

首先研究人員人工核查標準品的保留時間、準確分子量和MS2 譜圖后,從表1的結果中顯示,在RP(+)和HILIC(-)模式下,原始標準混合物(StdMix(H))在全掃描和DIA中確認的代謝物數量始終比DDA中略高。為了評估不同數據采集模式檢測低豐度代謝物的能力,研究人員使用稀釋的標準混合物(StdMix(L))進行了重復分析。研究人員在RP(+)和HILIC(-)分析中,發現與預期的一樣,StdMix(L)檢測到的代謝物數量比StdMix(H)顯著減少。與StdMix(H)結果相比,全掃描同樣檢測到了最多的代謝物數量,但DDA在被識別的代謝物數量中下降最大,在檢測低豐度代謝物方面DDA不如全掃描和DIA靈敏。

接下來、研究人員進一步在全掃描、DDA和DIA 模式下對人類尿液樣本進行非靶向分析。使用MS-DIAL軟件對尿液樣本中的peak提取、比對數據和代謝產物初步鑒定。數據處理參數手動優化,以達到最佳peak提取性能。

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圖2.在(A)RP(+),(B)HILIC(-)分析中通過三種采集方法分析的尿液樣品中檢測到的總peak數量、MS1注釋和MS2匹配的peak數量。

研究人員為了評估三種數據采集模式的分析差異,計算了檢測到的MS1注釋和MS2匹配的peak的總數(圖2)。在RP(+)和HILIC(-)分析中,無論尿液樣本濃度如何,全掃描和DIA模式比DDA模式能夠覆蓋更多的peak。

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圖3.(A)RP(+),(B)HILIC(-)分析中的peakMS信號強度的RSD分布。

除了檢測到的peak的數量,研究人員還對尿液樣本進行了技術重復(一式三份)。經MS-DIAL峰校準后,計算peak強度的相對標準偏差(RSD)。如圖3所示,三種采集模式結果中大于80%的peak 的RSD均小于 20%,且在全掃描和DIA中準確度極佳(RSD < 5%)。這一趨勢在不同濃度尿液樣本分析中結果是一致的。DDA始終具有最小的peak百分比(RSD < 5%),且與樣品類型、濃度、電離極性或色譜方法無關。說明DDA的定量準確度略低于全掃描和DIA。

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圖4.(A)RP(+)(B)HILIC(-)分析尿液樣品中DDA和DIA檢測到的MS2重疊特征

利用人類尿液樣本,研究人員比較了DDA和DIA模式下產生的MS2質譜的數量和質量。在 Urine(H)-RP(+),Urine(H)-HILIC(-), Urine(L)-RP(+), Urine(L)-HILIC(-)分析中,DDA模式下平均有43%的peak具有相應的MS2譜圖。DIA分析中100%的peak具有相應的MS2質譜圖。此外,DDA和DIA結果中的具有MS2質譜的共同peak以Venn圖顯示(圖4)。如圖所示,DIA比DDA能夠生成更多的MS2質譜圖。但是,研究人員發現DDA可以生成一些DIA中沒有找到的峰形較差、豐度較低的MS2譜圖。

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圖5. RP(+)和HILIC(-)分析中,DDA與DIA的質譜相似性得分分布。

除了MS2譜圖數量的比較,研究人員還評估了由DDA和DIA分析產生的RP(+)和HILIC(-)分析產生的Urine(H)MS2譜圖的質量。DDA和DIA檢測到的所有常見peak的Dot product score、該數值的大小與譜圖質量呈正相關。分布如圖5所示。由于代謝濃度不同,MS2譜圖的分布與代謝物標準相似,且有幾種代謝物匹配點積得分極低。DDA和DIA的點積分數分布結果表明,DDA產生的MS2質譜具有更好的分數,因此得到更好的譜圖質量。

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圖6.三種數據采集方法評估的總結

研究人員對非靶向代謝組學中全掃描(full scan)、DDA和DIA模式進行了綜合評估。每種數據采集模式都有其獨特性和局限性,會顯著影響代謝組數據的質量?偟膩碚f如圖6所示,(1)全掃描peak數量最多,其次是DIA和DDA。(2)因結果中超過80%的peak 的RSD低于20% 在LC-MS中是可以被接受的,故這三種采集模式的定量準確度具有一致性。(3)在DDA和DIA這兩種能夠得到MS2譜圖的采集模式相比,DIA的MS2譜圖數量高于DDA,但DDA的MS2譜圖質量高于DIA。另外,DDA具有使用方便、可以自動化進行鑒定、縮短工作流程時間的特點,在非靶代謝組學中十分具有競爭力。

百趣生物作為代謝組學科技服務領域的開拓者與領軍者,一直以來在非靶向代謝組學中使用DDA采集模式,為客戶提供優質高效的技術服務。

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