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樣本收集手冊 | 細胞和細胞培養液的收集方法及注意事項

分類:公司動態   發布時間 2021-03-25   閱讀: 1035

各位科研人,今天我們將給大家帶來細胞和細胞培養液的收集方法及注意事項。細胞作為生物代謝活動的起點場所,在代謝組學中的重要性不言而喻。細胞代謝也必然會影響到細胞生存環境——細胞培養液。近年來,以細胞為模型來探究疾病生物標志物以及疾病致病機制的科研活動越來越多。因此,樣本收集方法就顯得格外重要,結合我“趣”九年的實踐經驗,就細胞和細胞培養液的收集方法及注意事項為大家娓娓道來。

1
細胞樣本

樣品量要求: 
1*107 cell/sample,提供兩份樣本,其中一份作為備份,分兩管盛放。

淬滅試劑準備:
稱取85g AMBIC(碳酸氫銨)加入到1000ml超純水中,得到85g/l的AMBIC溶液。然后量取600ml 甲醇,100ml AMBIC (85g/l),290ml 超純水水,混合,用12M 鹽酸調節pH至7.4,最后用超純水定容至1L即可。

注意:由于pH的變化,淬滅試劑最好現配現用。

懸浮細胞[1]

樣本收集步驟:
1. 對細胞進行計數,計算1*107個細胞所需要的體積(即1體積);
2. 取5體積的淬滅試劑于試管中(試管的體積應為大于等于7體積),置于-20℃預冷;
3. 快速從細胞培養液中取出1體積的細胞,放入含有淬滅試劑的試管中;
4. 輕微震蕩試管10s,在1000g,4℃下離心1min,若細胞較小或細胞未沉淀,可適當加大轉速或延長離心時間,但不宜一次提升太多,以防止細胞破損;
5. 除去上清;
6. 將細胞放入液氮,30s后取出置于-80℃保存。

貼壁細胞

酶消化法[2]

樣本收集步驟:
1. 除去細胞培養基,迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞,清洗兩次;
2. 除去 PBS 溶液(一定要將 PBS 去除干凈,越快越好);
3. 消化:加入胰酶,消化至部分細胞呈球狀;然后加入培養基,輕輕晃動,使培養基浸潤細胞終止消化,吸出剩余培養基;加入 PBS 吹打,懸浮細胞;
(目的是把貼壁細胞消化下來,方便后繼處理,加入的溶液量及孵育時間可以根據自己實驗室具體情況進行修改);
4. 快速計數,取1*107個細胞所需要的體積(即1體積);
5. 快速放入預冷的5體積的淬滅試劑中,輕微震蕩離心管 10s;
6. 轉子-20℃預冷,在 4℃,1000g 條件下離心 1min,若細胞較小或未沉淀,可適當加大轉速或延長離心時間,但不宜一次提升太多,以防止細胞破損;
7. 除去上清,將細胞放入液氮中,30s 后取出保存在-80℃中。

刮細胞法(針對很難用酶消化下來的貼壁細胞)[2]

樣本收集步驟:
1. 除去細胞培養基,迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞,清洗兩次;
2. 除去 PBS 溶液(越快越好);(不能計數的話,建議測代謝物之前做蛋白定量)
3. 加入5體積淬滅試劑淬滅后用細胞刮分離細胞,將刮下的細胞轉入離心管中;
4. 在4℃,1000g 條件下離心 1min 去除上清。
5. -80℃保存,干冰運輸。

注意事項:
1. 取對數生長期,培養至同一時期的細胞,建議多準備樣本,以備后續使用;
2. 液氮處理細胞時,注意防止離心管破碎導致樣本受損;
3. 為防止樣本收集過程中細胞膜破裂,建議在全程操作不宜過度劇烈,切勿渦旋震蕩、高速離心或超聲等,同時避免反復凍融,以保證細胞膜不會破損,減少代謝組學分析影響;
4. PBS清洗時,切勿沖走細胞,清洗充分后,盡量將PBS完全倒掉。

收集方法參考文獻:
[1]Christopher A Sellick, Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling, nature protocol, 2011.
[2]Rahul Vijay Kapoore, Cell line dependence of metabolite leakage in metabolome analyses of adherent normal and cancer cell lines, metabolomics,2015.

2
無需淬滅劑細胞樣本收集方法
(備選方法,一般不建議使用)

懸浮細胞[1,2]

 樣本收集步驟:
1. 收集細胞并記數,1*107 cell/sample。
2. 將收集的細胞進行4℃離心,5min,1200rpm。
3. 使用PBS洗滌細胞,并在900rpm條件下離心。重復三次,去除PBS(盡量將PBS去除干凈)
4. 將含有細胞的EP管,迅速放入液氮中30s。
5. 放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。

貼壁細胞

刮細胞法[3]

 樣本收集步驟:
1. 將細胞用PBS進行多次清洗。
2. 用細胞刮將細胞刮入微離心管中,。
3. 將EP管迅速放入液氮中30s,然后進行凍干。
4. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。

酶消化法[4]

 樣本收集步驟:
1. 除去細胞培養基,迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞,清洗兩次。
2. 除去 PBS 溶液(一定要將 PBS 去除干凈,越快越好)。
3. 消化:加入胰酶,消化至部分細胞呈球狀;然后加入培養基,輕輕晃動,使培養基浸潤細胞終止消化,吸出剩余培養基;加入 PBS 吹打,懸浮細胞;(目的是把貼壁細胞消化下來,方便后繼處理,加入的溶液量及孵育時間可以根據自己實驗室具體情況進行修改)。
4. 快速計數,取 1 體積的細胞。
5. 轉子-20℃預冷,在 4℃,2500g 條件下離心 5min。
6. 去除上清,迅速放入液氮速凍30s,-80℃保存。干冰寄送。

收集方法參考文獻:
[1]Dehui Xu, Yujing Xu et al. Alteration of metabolite profling by cold tmospheric plasma treatment in human myeloma cells. Cancer Cell Int. 2018
[2]Zuzana Racovaa, Eva Anzenbacherova,et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2). Journal of Nutritional Biochemistry. 2020
[3]Sarah Hayton, arth L. Maker et al. Experimental design and reporting standards for metabolomics tudies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017
[4]Katja Dettmer,Nadine Nürnberger et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 2011.

3
細胞培養液

樣品量要求:
200μL/sample,提供兩份樣本并分 2 個離心管存放(條件允許最好 500μL/sample)。

樣本收集步驟:
1.將培養液搖勻,快速從培養瓶中取出一定量的培養液,4℃條件下離心(1000g,10min);
2.移取上清 500μL 至新的離心管中, 迅速放入液氮中淬滅,30s;
3.淬滅后放入-80℃中保存。

注意事項:
寄送樣本時請放入足量的干冰以保持低溫條件【經驗值:快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天,消耗速度與氣溫,泡沫箱厚度(>5cm)有直接關系,請酌情添加干冰】。

收集方法參考文獻:
[1]Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media , Analytical biotechnology, 2005.
[2]Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69. 
[3]Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: uenching and Extraction Protocols, metabolites, 2017. 

最后附上我們公司協助客戶發表的以細胞和細胞培養液為樣本發表的文章,各位老師在發表文章的時候也可以參考一下。
1. 上海市腫瘤研究所:Qiaozhu Zuo, Jia He, Shu Zhang, et al. PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis. Hepatology 2020 Apr 16. IF=14.971
2.中山大學:Qian Cao, Dan-Jie Zhou, Zeng-Yin Pan, et al. CAIXplatins: highly potent Pt(IV) prodrugs selectively against hypoxic tumors via microenvironment and metabolism regulation. Angewandte Chemie International Edition 2020 June 17. IF=12.959
3. 第三軍醫大學附屬西南醫院:Ou J,Peng Y,Yang W,et al.ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield. Nat Commun 2019 03 06;10(1). IF=12.353
4. 陸軍軍醫大學:Wei Xiang, Rongchen Shi, Xia Kang, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression. Nat Commun 2018; 9:2574. IF=12.353
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