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組學結果沒驗證就投稿?草率了吧!

分類:公司動態   發布時間 2021-05-12   閱讀: 802

科研界現在流行一句話:組學結果不驗證,reviewer不發通行證。早些年,組學結果驗證可是文章的高配,這些年,組學結果驗證已逐漸成了文章的黃金標準。各位大佬們千萬不要抱有僥幸心理,因為后續補充驗證結果真的很難。

急!急!急!我的轉錄組測序結果出來了,要不要做驗證?那么多的基因應該怎么選呢?驗證結果對不上怎么辦?好迷茫...................

淡定,今天小趣就和您一起學習學習。其實轉錄組結果的驗證方法還真不少呢(如表達量驗證、亞細胞定位、RNA結合蛋白、功能驗證等),今天我們主要了解一下表達量驗證之QPCR。

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基因如何選?

首先表達差異較大的,結果比較可靠。差異倍數也可以根據生物學重復適當調整,比如三個重復的差異倍數在2倍以上,5-10個重復的差異倍數可以適當降低,其次選擇與你研究內容相關的差異基因去驗證。另外,應當避免選擇表達量過低的基因;一般在有生物學重復的情況下,要求組內三個生物學重復的read count≥10;FPKM值至少在一個組大于1。當然了驗證基因的數量也不能太少哦。

2
樣本怎么辦呢?

基因選好了,我們再來看看樣本。是不是隨便拿一些樣本就可以?NO,NO,NO。RNA的表達具有時間、空間的特異性。不同時刻或者是同一時刻不同組織內RNA表達的數目差異是很大的,不同批次樣品的RNA表達也會有所不同,并且即使是同一批樣本,保存時間和方式對RNA也是有一定的影響。所以當轉錄組測序結果出來后應盡快安排驗證工作,后續驗證的RNA也要與做轉錄組的RNA來源保持一致。

3
引物設計又一大難點 

基因選好了,樣本也OK了,是不是就可以高枕無憂了?別急,要想驗證結果可靠,引物設計也是門學問。引物的GC含量要在40%~60%之間;Tm值60℃最好,上下游引物Tm值相差最好不超過2℃;擴增產物長度在80-150 bp之間最佳;避免出現二級結構和非特異性擴增;引物盡可能設計在基因的轉錄本共有外顯子上;引物設計好以后可以到NCBI-Primer Blast,進行特異性檢測,避免擴增假基因。實在不行您把序列發我,麻煩事就讓我做吧。我司可免費幫您做引物設計,后臺回復:“引物設計+姓名+單位+聯系電話”即可。

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QPCR檢測——漂亮的結果總該出現了吧

前期工作準備的差不多了,可以開始QPCR檢測了。啥?QPCR檢測原理您還不清楚?尷尬呀。Real-time PCR技術(QPCR):利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。優化實驗方法【擴增效率(90%-105%),3個技術重復不能少哦,且RSD<0.2】;最好是找專業的技術人員,否則結果用不了,不僅浪費樣本,關鍵還影響發文章呀。這里有其他小伙伴做的QPCR結果供各位老師參考:,各位老師可以瞧一瞧,如果您剛好有需求……嘿嘿,歡迎后臺咨詢哦~

最后還要提醒一下各位,轉錄組測序與QPCR定量雖然都看基因表達,但是他們卻是兩種不一樣的方法,會有很大概率的不一致,要做好心理預期。如果您還想做功能驗證的話,小趣這里有基因功能研究錦囊哦:。

祝您早日告別驗證煩惱,登上科研巔峰。

代謝組學

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