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百趣生物客戶文獻分享-急性髓系白血病的靶向治療及成像雙劍合璧

分類:公司動態   發布時間 2021-05-26   閱讀: 571

百趣生物客戶——陸軍軍醫大學發表了題為“Near-infrared oxidative phosphorylation inhibitor integrates acute myeloid leukemia–targeted imaging and therapy”文章,百趣生物為其提供中心碳代謝高通量靶標定量服務,以下是陸軍軍醫大學發表文章分享及解讀。


百趣生物客戶文獻分享

文章標題:Near-infrared oxidative phosphorylation inhibitor integrates acute myeloid leukemia–targeted imaging and therapy
發表期刊:SCIENCE ADVANCES
發表時間:2021 January
影響因子:13.116
合作客戶:陸軍軍醫大學
百趣生物提供服務:中心碳代謝高通量靶標定量



 研究背景 

急性髓系白血。ˋcute myeloid leukemia, AML)是一種致死性惡性腫瘤,由造血系統的髓系原始細胞惡性增殖并干擾正常血細胞生成導致,患者臨床表現為貧血、出血、感染、發熱、臟器浸潤和代謝異常等。AML的病情發展迅速,如不及時治療,患者可能在數月甚至數周內死亡;而更為棘手的是AML有幾率在治療后再次發作。目前治療AML的最大挑戰在于缺乏靶向定位顯示和殺傷異質性白血病細胞的手段,治療后殘留的白血病細胞再次增殖從而導致AML復發。

近年來腫瘤細胞發生發展過程的相關研究給予了治療AML非常重要的提示。糖酵解代謝通路的特異性增強,甚至在有氧環境中仍然傾向無氧糖酵解代謝是腫瘤細胞的重要標志之一。白血病細胞也屬于腫瘤細胞,同樣遵循相同的規律,因此過于活躍的糖酵解代謝是定位和治療AML的常規突破點。

早期的研究策略集中于抑制糖酵解,但是糖酵解抑制劑在治療AML上并沒有獲得令人滿意的效果。隨后的研究發現,一些類型的腫瘤比如腦癌和AML,除了糖酵解外,還能依靠于線粒體特有的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)來維持生物能量和生物合成的進程。特別是抵抗化療后的殘存白血病細胞,普遍地表現出線粒體體積增大,保持線粒體極化狀態等現象,更加依賴線粒體氧化磷酸化并籍此生存。因此突破治療AML的重點更傾向于針對白血病細胞線粒體的氧化磷酸化。

數種治療策略,比如抑制線粒體蛋白合成或抑制線粒體電子傳遞鏈,在治療AML中都表現出很好的潛力。然而線粒體是細胞代謝的重心,由于涉及生物能量和生物合成的進程,包括白血病細胞,幾乎所有類型的細胞(正常細胞)也都依賴于線粒體的完整性和各項功能,F有的氧化磷酸化抑制劑在抗腫瘤治療的應用中不僅限制對腫瘤細胞線粒體機能的理解,而且存在缺乏對腫瘤細胞的靶向定位,在腫瘤細胞中無法積累到有效治療濃度等問題。抑制劑不能靶向定位還會產生嚴重的副作用,比如神經毒性、惡心嘔吐等癥狀。



 化合物IR-26的設計思路 

針對上述問題,現階段的策略在于同時提升藥劑對腫瘤細胞靶向定位的能力和對腫瘤細胞線粒體氧化磷酸化抑制的能力。陸軍軍醫大學史春夢課題組之前已經在這一領域取得了可喜的研究成果,合成了能夠靶向定位實體腫瘤線粒體的七甲川花菁類近紅外熒光小分子化合物(heptamethine cyanine dyes,HCD)。承接這一思路,為了能夠更好的針對白血病細胞,本文作者在HCD的基礎上增加了水溶性氨基酸基團,設計出集靶向定位、成像檢測和治療于一身新化合物IR-26(圖一)。

和之前HCD在實體腫瘤線粒體的特異選擇性積累一致,新設計的IR-26在白血病細胞中也保持了這一特性。水溶性的IR-26的重大改進在于避免分子間氫鍵的形成,減少J聚集體的形成和血蛋白的結合率,更有利于靶向定位白血病細胞。IR-26保留了近紅外熒光的功能,吸收和發生峰在700-900nm之間。這個波段的近紅外線對組織具有高穿透性和低背景的自體熒光干擾,十分有利于成像;谏鲜鰞烖c,IR-26能在活體檢測中應用流式細胞儀動態檢測循環腫瘤細胞,這對于持續監測疾病發生,治療響應和疾病復發有重要的意義。

百趣生物七甲川花菁類近紅外熒光小分子化合物IR-26合成路線及結構

圖一 七甲川花菁類近紅外熒光小分子化合物IR-26合成路線及結構




 化合物IR-26對AML的靶向定位和成像 

為了研究IR-26的靶向定位和成像能力,外周血單個核細胞(PBMCs)和白血病細胞HL-60被分別和IR-26孵育,發現IR-26優先被白血病細胞吸收(圖二A)。白血病細胞的其它種類細胞系如NB4和THP-1相比PBMCs也會優先吸收IR-26(圖二B)。而在活體實驗中,無胸腺裸鼠(GFP標記HL-60腫瘤細胞實體腫瘤),對其靜脈注射0.2 mg/kg的IR-26, 成像結果表明,IR-26的成像非常清晰,與GFP成像結果一致而熒光背景更低(圖二 C)。

IR-26在體外和活體中的靶向定位和成像-百趣生物服務

圖二 IR-26在體外和活體中的靶向定位和成像

A PBMC和HL-60吸收IR-26后熒光強度(吸收越多,熒光越強);B PBMC和多種白血病細胞吸收IR-26后共聚焦成像照片;C 無胸腺裸鼠誘導GFP標記HL-60細胞腫瘤,注射IR-26后的彩照,NIR熒光成像,GFP熒光成像和X光成像。

為進一步調查IR-26在外周血中對白血病細胞的靶向定位能力,外周血單個核細胞(PBMCs)和預先構建好的GFP標記HL-60細胞被混合到一起來模擬復雜的外周血組分,同時加入5μM IR-26在37℃ 孵育。結果顯示IR-26能夠清晰顯示標記的HL-60細胞(圖三A)。而在白血病患者和健康志愿者的外周血比對中,IR-26也能夠清晰地識別患者血液中的白血病細胞(圖三B)。此外,還將GFP標記HL-60細胞注入輻照處理后的C57BL/6 小鼠體內建立AML模型,培養20天后將模型進行冰凍切片觀察,發現HL-60細胞除在外周血分布外,還會侵入脾臟和骨髓,而IR-26對所有位置的白血病細胞均能清晰成像(圖三 C)。

 IR-26在混合細胞、AML患者/健康志愿者和小鼠模型中對白血病細胞的定位和成像-百趣生物

圖三 IR-26在混合細胞、AML患者/健康志愿者和小鼠模型中對白血病細胞的定位和成像

A PBMC和HL-60混合吸收IR-26后熒光強度(由于只靶向白血病細胞,并被優先吸收,成像只顯示HL-60);B 白血病患者和健康志愿者外周血和IR-26孵育后成像;C 小鼠AML模型(注入GFP標記HL-60細胞)的不同部位成像。注:DAPI為4',6-二脒基-2-苯基吲哚,可以透過完整細胞膜,用于活細胞和固定細胞的染色。



 化合物IR-26對AML的治療效果 

在選擇性殺死白血病細胞方面,IR-26也有優異的表現,對于AML的兩類細胞HL-60和THP-1的半抑制率(IC50)在2.629 和2.351μM(圖四 A)。免疫印跡(圖四 B)和雙熒光標記(圖四 C)結果均顯示IR-26能夠有效地引導白血病細胞發生細胞凋亡。

正常造血干細胞(HSCs)和白血病細胞(HL-60)加入不同濃度IR-26后,對比細胞存活率,IR-26能夠對白血病細胞進行專一殺傷,即使是在對HL-60有高殺傷率的較高濃度時,對正常細胞損害也很。▓D五)。

圖五 造血干細胞(HSCs)和白血病細胞(HL-60)在不同濃度IR-26下細胞存活率

在小鼠活體模型方面,構建了兩個模型來測試IR-26的有效性。第一個模型通過在裸鼠皮下注射HL-60細胞產生實體腫瘤,當腫瘤達到一定大小后,將裸鼠隨機分為3組,分別腹腔注射PBS、阿糖胞苷和IR-26。結果顯示IR-26對于實體腫瘤的抑制作用顯著強于PBS組和阿糖胞苷組(圖六)。

圖六 小鼠腫瘤模型中 IR-26與PBS、阿糖胞苷對腫瘤大。ˋ)和質量(B)的抑制作用


第二個模型采用了非肥胖糖尿病/免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,通過尾部靜脈注射標記了GFP的人源AML細胞 HL-60來構建常規白血病模型(非實體腫瘤)。移植AML細胞后一周,小鼠分別注射5次阿糖胞苷或IR-26,25天后解剖小鼠并觀察器官。結果顯示對照組和阿糖胞苷組的小鼠各個器官都被白血病細胞侵入,呈現強GFP熒光,而IR-26治療的小鼠,其器官幾乎沒有GFP標記HL-60細胞的綠色熒光(圖七A)。此外,IR-26治療的小鼠,其生存時間也顯著長于對照組或者阿糖胞苷組(圖七B)。

 圖七 AML模型的不同治療對于白血病細胞侵入器官的效果和小鼠治療后的生存時間



 IR-26治療AML的分子機制 

對于IR-26阻斷線粒體功能的機制,本文也進行了探索。通過比對線粒體特異染料Mito Tracker 和IR-26的紅外熒光成像,證實IR-26的亞細胞定位為細胞線粒體(圖八A)。在線粒體吸收IR-26后,會導致線粒體腫脹并形成空泡(圖八B)。隨后的實驗發現,IR-26所在的線粒體會顯著產生高含量活性氧(ROS)(圖八C),而加入線粒體靶向超氧化物歧化酶(MitoTEMPO)后,可以在一定范圍內逆轉IR-26導致的ROS產生和細胞凋亡(圖八D)。

圖八 IR-26的亞細胞定位、線粒體形態、ROS含量和清除ROS后的細胞生存率


對于ROS的產生,更深入的機制則涉及線粒體的TCA循環和呼吸電子傳遞鏈。文中也對這兩個部分進行了探索。對于TCA循環,發現在IR-26在5-10μM的濃度下,電子傳遞鏈的復合物II的底物琥珀酸濃度會顯著上升,而下游代謝物延胡索酸和蘋果酸的濃度則顯著下降(圖九 A)。而使用氧化磷酸化試劑盒證實了TAC循環的代謝變化確實是由于電子傳遞鏈的復合物II和V受到抑制導致的(圖九 B)。從線粒體組分來看,下拉實驗表明IR-26會特異性結合線粒體蛋白ATP5B, SDHA和NDUFS1,最終導致呼吸電子傳遞鏈失活。

圖九 IR-26的對于TCA循環、呼吸電子傳遞鏈和線粒體蛋白的作用



 總 結 

文章實驗針對急性髓系白血病的特點設計了靶向成像和治療一體化的化合物IR-26,該化合物能夠靶向定位AML細胞,熒光成像清晰準確。在治療方面,IR-26可以有效殺傷AML細胞,對正常細胞和治療個體的副作用很小。治療機制方面,IR-26通過錨定ETC蛋白、SHDA和ATP5β;抑制電子傳遞鏈的復合體II和復合體V進而抑制線粒體氧化磷酸化并產生ROS使得AML細胞發生細胞凋亡。


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