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蛋白質組學【入門必看】| 常見蛋白質組學技術流程

分類:公司動態   發布時間 2021-07-28   閱讀: 2369

上一次小趣整理了蛋白質組學入門的一些基礎知識,如什么是蛋白質組學?蛋白質組學常用技術有哪些?蛋白質組學檢測儀器平臺有哪些?蛋白序列數據庫等等。今天我們繼續探索蛋白質組學的世界,了解常見蛋白質組學技術流程!


非靶向蛋白質組學

1. iTRAQ/TMT 標記定量蛋白質組學

iTRAQ 和 TMT 技術采用多種同位素標記,可與氨基反應實現連接,實現多個樣本蛋白組的定性與定量。


技術流程:


寄樣要求:

動物及臨床組織標本  100 mg/sample

血清、血漿  200 μL/sample

細胞、微生物  1x107 cells/sample

植物嫩葉、嫩芽  500 mg/sample

植物種子、果實  100 mg/sample

液氮或者 -80℃ 保存

足量干冰運輸,避免反復凍融


試劑盒種類:


技術優點:

適用范圍廣、高通量、結果可靠

靈敏度高

分離能力強

自動化程度高


2. Label Free 非標記定量蛋白質組學

Label Free 技術不依賴同位素標記,可通過液質聯用對蛋白質酶解肽段進行分析,分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據,對被檢測到的離子峰強度進行積分,以積分面積進行相對定量。


技術流程:


技術優點:

無需標記,最大程度的保留樣本的真實性

可以區分“有”、“無”蛋白

不受標簽數量的限制,多個樣本可以同時進行蛋白定量分析

不同物種和不同的樣本類型可以同時開展蛋白定量分析

處理步驟簡單,成本低


技術缺點:

低通量

定量準確度有限

對質譜的穩定性和重現性有很高的要求


3. DIA 定量蛋白質組學

數據非依賴性采集(DIA)是一種顯著提升蛋白質組學研究通量和可重復性的技術。


經典的 DIA 流程通常依賴于 DDA 譜圖庫的構建,需要消耗大量的樣品,且周期長,成本高。


越來越多的不依賴于 DDA 建庫的分析方法相繼誕生,例如 DIA-Umpire、PECAN 和 encyclope DIA 等。encyclope DIA 系列技術采用氣態在線分離(GPF)。


GPF-DIA 技術流程:


常規 DIA 流程:



技術優點:

采集所有離子及碎片圖譜,重現性好

基于碎片離子定量,選擇性好,可媲美 SPM/MRM

循環時間固定,掃描點數均勻,定量準確度高

高通量,能同時監測所有目標蛋白


4. 定性鑒定蛋白質組學

利用液相色譜質譜聯用技術(LC-MS/MS)結合數據庫檢索的方法,對樣本中的混合蛋白進行定性鑒定分析。


技術流程:

寄樣要求:

  • 膠條樣本

考馬斯亮藍染色 SDS-PAGE 凝膠,條帶清晰可見

條帶切取操作過程中佩戴手套,防止角蛋白污染

條帶置于 EP 管中,-20℃ 保存,冰袋運輸


  • 蛋白溶液

需要提供緩沖液體系以及蛋白濃度數據

蛋白溶液樣本中不要加入 loading buffer

液氮或 -80℃ 保存

足量干冰運輸,避免反復凍融


5. 多肽組學

多肽組學是以機體內源性多肽和低分子量蛋白質為研究對象,研究多肽組的結構、功能、變化規律及其相關關系。


技術流程:


技術優點:

高效

高通量

高特異性

破壞度小

高靈敏度



靶向蛋白質組學

(PRM 靶向定量蛋白組)


平行反應監測(PRM)是一種靶向檢測方法,能夠對目標蛋白、目標肽段進行選擇性檢測,從而實現對目標蛋白/肽段進行相對(絕對)定量。


技術流程:


技術優點:

不依賴抗體

特異性

結果準確、可靠

高通量


修飾蛋白質組學


利用 LC-MS/MS 結合數據庫檢索的方法,在搜庫時設置修飾搜庫參數,實現對目標所有已知的修飾位點磷酸化、乙;、糖基化和泛素化進行鑒定。


技術流程:



蛋白代謝互作組


代謝物-蛋白質相互作用控制著多種細胞過程,從而在維持細胞穩態中發揮重要作用。MetPro 技術是一種化學蛋白質組學方法,將蛋白質水解(Lip)和質譜(MS)結合起來。用于進行代謝物-蛋白質相互作用的研究,篩選與代謝物具有相互作用的蛋白質。


技術流程:


蛋白組生信分析


1. 基礎分析

 數據預處理

 差異表達蛋白篩選


2. 常規數據分析


 主成分分析

火山圖分析


層次聚類分析

3.功能分析


 COG 注釋分析

亞細胞定位分析


GO 注釋富集分析


KEGG 注釋富集分析


PPI 網絡構建分析


4.修飾蛋白特有分析


Motif 分析

激酶(kinase)預測分析


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