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上分攻略 | 蛋白質組學FAQ-2

分類:公司動態   發布時間 2021-10-21   閱讀: 267

上期的蛋白組學FAQ文章推出后(上分攻略1 | 蛋白質組學FAQ)老師們積極關注,那么這期再給各位老師整理些經常咨詢的問題,以供參考。


Q & A

  Q1  蛋白組一般是建議做多少個生物學重復?

A: 原則上是生物學重復越多越好,排除個體差異,篩選的差異蛋白更準確,驗證成功率更高?紤]到經費、統計分析需要及后續編輯可能會質疑的情況,臨床樣本建議每組十個重復以上,其他來源樣本每組至少三個重復。



  Q2  蛋白組樣本如何寄送?

A: 常規組織、細胞、體液等生物樣本需要低溫保存,干冰寄送。膠條樣本可以冰袋寄送。



  Q3  : 蛋白組學能否測未知的蛋白?或者是表達的外源蛋白,該樣本物種數據庫里沒有的蛋白能否測到?

A: 蛋白組學檢測結果是與已知的數據庫蛋白進行比對,無法預測未知的蛋白,如果需要檢測未知蛋白,可采用測序等其他方法。如果數據庫里不包含關注的蛋白,那么無法比對到?梢詫㈥P注的蛋白序列加入到數據庫里作為搜庫文件進行分析。



  Q4  : 磷酸化蛋白組學實驗的流程?

A: 磷酸化蛋白組可以做非標記產品,也可以做標記產品。目前標記產品做的較多,可以增加檢測深度。實驗流程主要是包括樣本前處理、蛋白的提取、蛋白濃度的測定和跑膠質控、酶解成肽段、修飾肽段的富集、(肽段標記)、質譜檢測。方案多樣化,可以進行選擇,可以先富集再分級再檢測,或者先標記、分級、每級富集等等。



  Q5  : 蛋白檢測結果較少是為什么呢?

A: 首先可能是數據庫比較小的原因,導致檢測到的結果比較少?梢赃x擇擴大層級或者選擇研究較多的近緣物種、模式物種數據庫進行搜庫分析。其次看下膠圖,判斷樣本本身條帶是否較少,是否存在高豐度蛋白,高豐度蛋白的存在會影響檢測數量。



  Q6  : 鑒定到的蛋白與凝膠電泳圖譜中估測分子量差異很大的原因?或者為什么SDS-PAGE膠上不同位置條帶的質譜鑒定結果中含有同一個蛋白?

A: 由于體內或者體外因素,導致同一蛋白存在不同形式的修飾、剪切或者降解,從而形成凝膠電泳圖中能夠看到的存在差異分子量的蛋白條帶。然而這些蛋白在質譜鑒定時會同時指向數據庫中同一個、全長的、無修飾的蛋白理論序列。因此會出現凝膠電泳圖中的蛋白分子量(實際分子量)與鑒定的蛋白分子量(理論分子量)不同的情況。



  Q7  : 差異蛋白如何篩選?

A: 差異蛋白篩選的條件主要是結合T檢驗的p值和FC值,一般標記產品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非標記產品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05進行篩選。實際過程中也會結合檢測結果進行放寬或者卡嚴,一般控制在檢測結果20%以內,5-10%為佳。



  Q8  : 做完蛋白組學,選用何種方法驗證呢?

A: 常規蛋白驗證方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果關注的蛋白數量不多且有對應的商品化檢測試劑盒或者抗體,建議選擇ELISA或WB方法進行驗證,此方法更為成熟。如果關注的蛋白數量較多,也沒有商品化的抗體,建議選用PRM的方法。經費充裕的情況下,抗體制備也是一個不錯的選擇。



  Q9  通過western blot檢測到的蛋白,為什么質譜沒有檢測到或者只檢測到一個肽段?

A: Western blot 檢測是將目的蛋白信號放大很多級之后進行檢測的,靈敏度很高,(除非特異性結合之外)幾乎不受復雜樣品中背景蛋白豐度的影響。質譜檢測時樣品中豐度較高的蛋白優先、多次被檢測到,而豐度較低的蛋白則因為肽段信號過弱被淹沒而不能被檢測到。因此,如果樣品中待檢測的目標蛋白豐度較低,即使WB能夠檢測到,質譜并不一定能檢測到或者僅能檢測到較少的肽段數。



  Q10  : 同一批樣本,轉錄組數據下調,但是蛋白組學結果上調,這種是什么情況?

A: 這是正常的現象,上下游不是一一對應的關系,常規mRNA與蛋白質間的相關系數僅為0.4~0.5。一個蛋白的表達受到很多因素的控制,除了這個蛋白對應的mRNA之外,還有比如轉錄因子,增強子,抑制子,DNA和RNA的修飾作用等等。


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