玩朋友的丰满人妻,朋友的丰满人妻中文字幕,从后面挺进邻居丰满少妇

新聞資訊

NEWS

客戶文章 | 腎透明細胞癌致瘤機制:KDM5C基因缺失致使糖原代謝重編和抑制鐵死亡

分類:公司動態   發布時間 2021-12-17   閱讀: 46

文章標題:Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis

發表期刊:Theranostics

發表時間:2021.08.04

影響因子:11.556

合作客戶:武漢大學

百趣提供的服務:PPP、EMP靶標代謝流



研究背景

腎透明細胞癌 (ccRCC) 是最常見的腎癌形式,病癥表現為富含脂質和糖原的細胞質沉積物增加。研究表明,ccRCC中諸多基因位點發生突變,其中VHL基因和染色質修飾基因KDM5C。盡管已證明VHL缺失可導致糖原累積,X染色體上KDM5C基因失活逃逸導致男性為主要患者,但其潛在機制仍不清楚。

此外,ccRCC患者存活率較低可能與磷酸戊糖途徑(PPP)的上調有關,因此糖原代謝可以作為治療靶點,但是,ccRCC中糖原累積和相關致癌功能的遺傳因素尚不完全清楚。

本文利用全外顯子組與RNA測序評估KDM5C在ccRCC中的功能,結合靶標代謝流研究KDM5C如何影響細胞內代謝通量。同時還對小鼠進行KDM5C基因敲除收集更多的體內證據,揭示了組蛋白修飾基因失活突變重編程糖原代謝的機制,并有助于解決人類癌癥中男性占主導地位的長期難題。


研究內容

具有最高糖原水平的 ccRCC 細胞系存在著 KDM5C 基因移碼突變

對ccRCC 6個細胞系進行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量測定發現,相比于其他同樣缺乏 VHL基因的癌細胞系,RCC4表現出最高的糖原水平(圖1 A、B)。此外,外顯子測序結果表明RCC4細胞中KDM5C和VHL出現移碼和錯義突變,WB結果發現RCC4細胞中不存在KDM5C和VHL蛋白(圖1 C、D),由此表明癌細胞中的高糖原水平可能與KDM5C突變有關。


為了驗證KDM5C的恢復是否會降低RCC4細胞中的糖原水平,構建了野生型KDM5C或其酶失活突變體H514A的RCC4細胞系,PAS染色結果和糖原定量測定結果表明KDM5C能有效降低糖原水平(圖1 E、F),KDM5C突變促進ccRCC中糖原的形成。


鑒于KDM5C是X失活逃逸基因,作者分析不同性別的患者的情況,發現在ccRCC中頻繁突變的基因中,KDM5C突變表現出最高的男女比例(圖1 G),KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降,同時糖原顯著增加(圖1 H),這就解釋了為什么ccRCC患者大部分為男性。


圖1. X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC細胞系中具有移碼突變


KDM5C缺失引起ccRCC特異性代謝表型

為了證實KDM5C缺失導致ccRCC發生和糖原積累,作者進行KDM5C敲除實驗。在對照組中,雌性腎臟中的KDM5C蛋白水平高于雄性(圖2 A)。相比于對照組,在50%的KDM5C敲除小鼠中觀察到腎囊腫(圖2 B),其管腔的上皮細胞顯示出強Ki67染色(圖2 C),KDM5C敲除小鼠的腎小管表現出細胞質糖原累積升高(圖2 D), 表明KDM5C缺失可能引發ccRCC特異性代謝表型并促進腫瘤形成。另外,KDM5C敲除穩定細胞系的PAS染色和糖原定量結果均表明KDM5C耗盡后糖原水平增加(圖2 E-H)。

圖2. KDM5C敲除引發ccRCC特異性代謝表型


為了明確VHL和KDM5C兩者在糖原累積作用的聯系,作者另外對Caki-1細胞進行敲除實驗,發現VHL和KDM5C任何一種缺失都會導致糖原累積,二者同時敲除存在累加效應,表明KDM5C可能具有獨立于VHL/HIF的調節糖原的能力。(圖3)

圖3. 構建的caki-1細胞系的糖原水平


KDM5C組蛋白去甲基化酶活性是其在調節參與糖生成、糖原分解和PPP的基因表達的作用所必需的

為了探索KDM5C在糖原代謝中的作用機制,作者對ACHN-shKDM5C、 RCC4-KDM5C細胞系以及對照組進行轉錄測序。結果發現KDM5C基因與中樞代謝、HIF反應、氨基糖代謝和轉錄失調相關,表明KDM5C對細胞代謝調節至關重要(圖4 A、B)。除此之外,鑒定了幾個參與糖原合成/降解和PPP的基因,包括HK2、GYS1、PGM1、PPP1R3C以及控制葡萄糖向PPP流動的關鍵基因G6PD,這些基因均在KDM5C敲除后表現出高表達,由此表明KDM5C可能會抑制ccRCC細胞中的HIF基因表達和葡萄糖向PPP分流(圖4 C-E)。


WB結果表明KDM5C表達會降低基因啟動子的H3K4me3水平(圖4 F),且KDM5C敲除會導致除了PPP1R3C之外的那些基因的啟動子上H3K4me3的水平增加(圖4 G),表明KDM5C能夠直接調節HK2、GYS1、PGM1和G6PD的基因表達。由此得到一個結論:KDM5C缺失導致H3K4me3水平提升進而促進糖原相關基因的表達。


圖4. KDM5C 抑制糖原代謝需要組蛋白去甲基化酶活性


KDM5C抑制葡萄糖向PPP的流動

盡管上述結果表明KDM5C可以同時調節糖原代謝和PPP,但其具體調控的方向仍不清楚。于是作者利用靶標代謝流技術確認KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動。結果發現在恢復KDM5C的RCC4細胞中,G6P、6-PG、R5P、EMP的F6P和乳酸的同位素信號顯著減弱(圖5 A),表明KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動和糖酵解。此外,細胞內代謝物定量結果發現RCC4中的G6P水平高于其他ccRCC細胞系(圖5 B),KDM5C抑制了參與PPP和糖酵解的幾種產物的產生(圖5 C和D)。 


有趣的是,KDM5C同樣有效降低了G6P和NADPH的水平(圖5 E), 盡管VHL降低了糖原含量,但未能降低G6P和NADPH的水平。與其他代謝物類似,KDM5C突變降低GSH水平。同樣,KDM5C缺失導致ccRCC細胞系的PPP底物G6P、PPP產物NADPH和GSH增加(圖4 F)。

圖5. KDM5C通過戊糖磷酸途徑抑制葡萄糖通量


KDM5C主要通過促進鐵死亡來抑制致瘤性

PPP在抗ROS活性和腫瘤侵襲上具有重大意義,其中間產物NADPH是鐵死亡的指標。為了明確KDM5C在ROS抗性和鐵死亡中的潛在作用,作者通過ROS誘導處理來比較各種ccRCC細胞系ROS抗性。與其他ccRCC細胞系相比,RCC4表現出相對較高的ROS抗性(圖6 A)。在用TBHP處理后,與RCC4-H514A細胞相比,RCC4-KDM5C有更多的細胞死亡(圖6 B)。同時,在TBHP誘導下,KDM5C導致ROS水平顯著增加(圖6 C)。此外,KDM5C顯著增強了Erastin介導的細胞死亡(圖6 B),這可以被Ferr-1或DFO有效逆轉,但不能被Z-VAD或Nec-1s逆轉。因此,與RCC4-H514A細胞相比,RCC4-KDM5C細胞中Erastin誘導的脂質過氧化增加更明顯(圖6 D)。

圖6. KDM5C主要通過抑制鐵死亡來抑制致瘤性


KDM5C敲除賦予癌細胞對ROS和鐵死亡的抵抗力

敲除KDM5C后,與幾種ccRCC細胞系對TBHP和Erastin的抵抗力顯著增強(圖7 A、B)。值得注意的是,在糖原磷酸化酶抑制劑(GPI)會抑制其抗性(圖7 C),這表明KDM5C蛋白介導的糖原重編程的缺失對于抗ROS和鐵死亡是必不可少的。

圖7. KDM5C的缺失使老化的腎細胞和ccRCC細胞對鐵死亡具有抗性


癌癥相關的KDM5C突變在抑制糖原積累和促進鐵死亡方面存在缺陷

測序鑒定到大部分突變在JmjN和JmjC結構域中富集(圖8 A),為了評估這些癌癥相關的KDM5C突變對糖原積累和鐵死亡的影響,選擇了幾個JmjN和JmjC結構域相關的錯義突變,并構建了穩定表達突變蛋白的相應RCC4細胞系(圖8 A)。有趣的是,所有這些突變體都表現得像H514A,不能有效地降低糖原和G6P水平(圖8 B),并且它們都沒有使細胞對鐵死亡或ROS誘導劑敏感(圖8 C)。

圖8. 臨床相關的KDM5C突變體未能降低糖原水平并抑制鐵死亡


基于前面的結果,作者提出了ccRCC中失活KDM5C突變的模型。如圖9所示,雌性KDM5C有兩個活性等位基因;因此,在單個基因改變后,雌性不會完全喪失基因。相比之下,在男性中,一個腎細胞突變使KDM5C基因的唯一等位基因失活,從而可能通過增加糖原生成/糖原分解和抑制鐵死亡來促進腫瘤發生。因此,男性更容易患ccRCC。

圖9. 失活KDM5C突變和ccRCC發病模型


結 論

該文章揭示了組蛋白修飾基因KDM5C失活突變重編程糖原代謝和隨后的PPP,并誘導了鐵死亡抗性,從而擴展了KDM5C功能庫,這些功能對于ccRCC的腫瘤發生至關重要,有助于解釋人類癌癥中男性占主導地位的長期難題。此外,該研究結果可能表明在ccRCC中靶向糖原代謝的治療價值。

文獻原文下載鏈接:https://pan.baidu.com/s/1XG3VkZOFioVvMWu_mrsARA

提取碼:yx87

有興趣采用靶標代謝流進行樣本檢測分析的老師,歡迎垂詢服務熱線:400-664-9912。


玩朋友的丰满人妻,朋友的丰满人妻中文字幕,从后面挺进邻居丰满少妇