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阿趣生物助力預測肝癌治療關鍵靶點,或成治療新策略

分類:公司動態   發布時間 2020-06-08   閱讀: 1269

肝癌是全球第六大腫瘤,排在因癌癥疾病死亡的第四位。2015年,全世界肝癌發病85.4萬例,死亡81萬人,半數病例和死亡發生在中國。肝細胞癌占原發性肝癌的75%-85%。雖然肝癌的診斷和治療已經取得進展,但治療后5年生存率仍為25%-39%,晚期肝癌患者的復發率約為80%。因此,迫切需要了解肝癌進展和轉移的機制,這將有助于制定治療方案,同時延長肝癌患者的生存期。 

近期發表在Hepatology雜志,IF=14.97,標題為PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis的文章。研究并探討了PGC1α對肝癌預后的影響,并發現PGC1α可能是肝癌患者的候選治療靶點,有望為肝癌治療提供新思路。

接下來讓我們一起看看詳細的研究內容。重編程代謝是癌癥進展的重要標志之一。有氧糖酵解,也被稱為沃伯格(Warburg)效應,是腫瘤細胞最具特征的代謝表型。相關證據表明,糖酵解不僅是由缺氧條件導致的,也可能是致癌信號。然而,有氧糖酵解在肝癌中的作用和分子機制尚不清楚。過氧化物酶增殖物激活受體γ-輔激活因子-1α(PGC1α)它是一個小的轉錄輔激活因子家族的成員,主要促進線粒體的生物生成和呼吸作用。在HCC中,PGC1α的表達水平較低,但PGC1α在HCC疾病進程中和有氧糖酵解中的生物學功能和分子機制尚不清楚。

研究人員收集了肝癌患者的癌組織及癌旁組織,在3年間進行PCR,Western blot ,免疫組化(IHC)實驗,同時還進行了隊列分析。分析結果顯示TCGA(n=50)和GSE14520(n=214)隊列研究分析中,發現PGC1α在肝癌中下調(圖1A)。采用實時PCR技術對65例肝癌組織及癌旁組織中PGC1α的表達水平進行檢測。如圖1B-C所示,與相應的非腫瘤肝組織相比,腫瘤組織中PGC1α的mRNA水平降低了72.3%。western blot(圖1D)和IHC分析進一步證實PGC1α下調。

代謝組學
1A:TCGA和GSE14520隊列研究中PGC1α含量的變化情況; 1B-C:qPCR檢測肝癌組織及癌旁組織中PGC1α的表達水平;1D: Western blot分析

為探討PGC1α在肝癌組織中下調的臨床意義,對233例肝癌患者的組織芯片(TMAs)進行了免疫組化實驗,圖1E顯示根據免疫組化結果將233例肝癌患者分為兩組:PGC1α高表達組(n=126)和PGC1α低表達組(n=107)。生存分析顯示,PGC1α表達水平低的肝癌患者總生存率(OS)(P=0.0002)和復發時間(TTR)(P=0.0328)低于PGC1α水平高的患者(圖1F)。由此猜測PGC1α可能是預測肝癌患者預后情況的一個有價值的因素。

代謝組學
1E:肝癌患者的免疫組化分析;1F:生存實驗統計分析

為了探討PGC1α在肝癌細胞中的生物學功能,研究人員建立了PGC1α在HCCLM3和MHCC97H細胞系中過表達的穩定模型,并建立了敲除PGC1α的模型。移行和侵襲試驗表明,PGC1α的過表達顯著抑制了HCC細胞的遷移和侵襲性(圖2A-B),而PGC1α的敲除顯著促進了HCC細胞與對照細胞相比的遷移和侵襲性(圖2C)。

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2A-C:PGC1α的過表達和PGC1α敲除后細胞的遷移和侵襲性分析

此外,為了在體內證實上述發現,研究人員將穩定的細胞株注入裸鼠的側尾靜脈,建立肺轉移模型。8周后,與對照組相比,注射PGC1α高表達HCCLM3細胞的小鼠肺轉移結節較少(圖2D)。相反,PGC1α的敲除顯著增加了肺轉移結節的數量(圖2E)。肺轉移結節的大小略有不同,但無顯著性差異。此外,腫瘤數據挖掘和臨床樣本顯示,PGC1α的表達量在肝癌發生過程中逐漸減少。這些結果提示PGC1α在體內外均能抑制肝癌細胞的遷移和侵襲,可能在肝癌的發展和轉移中起到抑癌作用。

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2D-E:肺轉移動物模型組織切片分析肺轉移結節數量分析

之前有報道稱,PGC1α在幾種癌癥的發展過程中參與了重編程代謝。研究者假設肝癌細胞中PGC1α的抑瘤活性伴隨著一個整體的代謝重編程。為了驗證這一假設,研究者使用超高效液相色譜-質譜法(UHPLC-MS)對HCCLM3細胞進行了代謝組學分析(圖3A-B)。UHPLC-MS分析和之后的生化分析顯示,三羧酸循環(TCA)和糖酵解因PGC1α過度表達而發生顯著改變(圖3C-D、3E-F)。

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3A-F:細胞代謝組學非靶檢測分析

同時,研究人員還分別比較了PGC1α高表達或基因敲除的肝癌細胞和對照細胞之間的關鍵細胞代謝和生物能量參數。結果表明,PGC1α的過表達顯著提高了HCCLM3和MHCC97H細胞的基礎耗氧率和最大耗氧率(OCR),降低了細胞外酸化率(ECAR)圖4A。相反,PGC1α的敲除降低HepG2和SMMC7721細胞的OCR和ECAR(圖4B。另外,PGC1α的過度表達導致細胞ATP水平、葡萄糖攝取量和細胞外乳酸水平的降低(圖4C),而PGC1α的敲除降低了細胞內ATP水平和葡萄糖攝取量,并增加了細胞外乳酸水平(圖4D)。

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4A-D:細胞代謝和生物能量檢測

為了探討Warburg效應與HCC細胞的進展是否有關,用HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞分別使用不同濃度的2-DG處理,結果顯示2-DG對HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞的糖酵解有明顯的抑制作用。HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞的遷移和侵襲能力也呈劑量依賴性下降(圖4E)。為了證明糖酵解調節肝癌的遷移和侵襲,研究人員在含有半乳糖的培養基中培養細胞,從而減少糖酵解通量,迫使細胞依賴于氧化磷酸化。結果表明,糖酵解通量的減少大大消除了PGC1a基因敲除引起的HepG2細胞遷移和侵襲能力的增加。這些結果表明,PGC1α促進肝癌細胞的氧化磷酸化,同時抑制肝癌細胞的有氧糖酵解(沃伯格效應),PGC1α通過抑制肝癌細胞系的沃伯格效應抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。

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4E:細胞遷移和侵襲驗證

為了進一步探討PGC1α調節有氧糖酵解的機制,研究人員評估了PGC1α對重要糖酵解酶表達的影響。利用qPCR檢測了13種糖酵解酶的mRNA水平,發現除丙酮酸脫氫酶激酶(PDK1)和乳酸脫氫酶(LDHA)外,大多數酶的表達水平沒有改變,PDK1的表達水平也基本改變(圖4F)。糖異生、氧化磷酸化和肝臟特異性葡萄糖轉運蛋白的標記物也通過qPCR進行定量(圖4G)。

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4F-G: qPCR檢測mRNA水平

接下來,研究人員探討PDK1是否參與PGC1α基因敲除調節的糖酵解增加。研究發現,當siRNAs敲除PDK1后,PGC1α敲除誘導的HepG2和SMMC7721細胞乳酸生成量的增加明顯減弱。接下來進一步探討了PDK1在PGC1α介導的腫瘤進展中可能的作用。結果表明,PDK1的沉默逆轉了肝癌細胞的遷移和侵襲活性,PGC1α的敲除增強了這種活性。此外,PDK1在體內也可以被PGC1α調節。這些結果提示PDK1是PGC1α調節有氧糖酵解的功能下游靶點,對PGC1α介導的腫瘤進展至關重要。

為了弄清楚PGC1α抑制PDK1的機制。研究人員發現WNT信號通路與HCCLM3細胞中的PGC1α顯著負相關。采用TOP/FOPFLASH報告法分析PGC1α表達對肝癌細胞WNT/β-catenin通路的影響。發現PGC1α的過度表達顯著抑制了HCCLM3細胞中β-catenin的轉錄活性,而PGC1α敲除后HepG2細胞中TOPFLASH報告活性顯著增強(圖5A)。同時發現丙酮酸脫氫酶(pSer293 PDH)作為PDK1的靶點,其升高水平也被WNT/β-catenin途徑抑制。β-catenin蛋白水平隨著PGC1α的過度表達而降低,隨著PGC1α的敲除而升高。提示PGC1α通過抑制WNT/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞PDK1的表達。

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5A:HCCLM3細胞中β-catenin的轉錄活性檢測

PPARγ能夠誘導典型WNT/β-catenin途徑抑制并促進葡萄糖穩態。因此,研究PGC1α誘導的WNT/β-catenin信號抑制和抗Warburg效應是否是通過PPARγ依賴方式介導的則尤為重要。雙熒光素酶報告分析顯示,PGC1α過表達的HCCLM3和MHCC97H細胞中PPARγ的轉錄活性顯著上調(圖6A)。PPARγ基因敲除逆轉PGC1α誘導的WNT/β-catenin信號傳導抑制(圖6B)。提示PGC1α對肝癌細胞WNT/β-catenin信號傳導的抑制作用依賴于PPARγ。

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6A-B: PGC1α過表達及PGC1α敲除的雙熒光素酶實驗

接下來在轉錄組水平上評估PGC1α對HCCLM3細胞整體基因表達模式的影響(圖7A)。通過基因集富集分析(GSEA)研究轉錄組變化對生物功能和途徑的變化。結果發現WNT信號通路與HCCLM3細胞中的PGC1α顯著負相關(圖7B)。提示PGC1α通過抑制WNT/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞PDK1的表達。

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7A: HCCLM3細胞整體基因表達模式分析;7B: 基因集富集分析


為了探討PDK1在HCC中的預后價值,實驗人員分析了233例肝癌手術切除患者中PGC1α和PDK1的表達。肝細胞癌組織中PGC1α和PDK1的代表性照片如圖8A所示。PGC1α高表達的肝細胞癌組織中PDK1的染色較弱,而PGC1α低表達的肝細胞癌組織中PDK1的染色較強。對233例肝癌組織中PGC1α表達量與PDK1表達量的關系進行分析后發現PGC1α表達與PDK1表達呈現顯著負相關(圖8B)。研究人員還分析了233例肝癌組織中PGC1α和PDK1表達水平的預后價值。Kaplan-Meier分析顯示PGC1α高表達和PDK1低表達的肝癌患者OS最高,復發率最低(圖8C)。結果提示PDK1在PGC1α介導的肝癌進展中起作用。

代謝組學
8A: 肝癌手術切除患者中PGC1α和PDK1的表達量分析;8B:PGC1α表達與PDK1表達相關性分析;8C: 預后分析

綜上所述,在本文中首先研究了PGC1α在肝癌轉移和代謝中的作用和機制。PGC1α通過抑制WNT/β-catenin途徑下游靶點PDK1的有氧糖酵解抑制肝癌細胞的體內外轉移。PGC1α對WNT/β-catenin通路的抑制作用依賴于PPARγ。本文闡明了PGC1α作用的新見解,并提示PGC1α可能是肝癌新治療策略的一個有希望的靶點。

文章延伸

阿趣生物為本研究提供了LC-MS非靶標代謝組學檢測分析服務。

通過液質聯用(LC-MS)方法檢測生物體受外界刺激前后體內大多數小分子代謝物的動態變化,重點尋找在實驗組和對照組中有顯著變化的代謝物,進而研究這些代謝物與生理病理變化的相關關系,其研究對象大都是分子量1500Da以內的小分子物質。

技術優勢 
較高的靈敏度、分辨率; 
較寬的動態范圍; 
適合于生物樣本中復雜代謝產物的檢測和潛在標志物的鑒定;
適合對標本中未知代謝物的探索研究。

應用方向
表型和生理功能研究;
疾病病理研究 ;
臨床診斷及治療;
藥物研究 ;
中醫理論研究;
食品科學與營養學研究;
畜牧與農林業研究;
環境毒理研究。

有需要LC-MS非靶標代謝組學檢測分析服務的老師,歡迎在文末留言或者垂詢服務熱線:400-664-9912。

參考文獻:
Qiaozhu Zuo, Jia He, Shu Zhang, et al. PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis. Hepatology 2020 Apr 16.

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提取碼:cl31


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