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文獻分享 | 樣本凍融對代謝組學的影響

分類:行業資訊   發布時間 2020-06-28   閱讀: 1590

Translation of differences in the metabolomes into the phenotypic difference of the samples — Metabolomics

代謝組學的樣本收集及保存有很多需要注意的點,比如樣本分裝,低溫保存,不可凍融,血液樣本不能溶血等等,今天要給大家分享的文章是血清樣本凍融之后的代謝影響。

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血清血漿是代謝組學中很常見的樣本,當樣本沒有分裝的時候很容易出現解凍后再凍存的情況,因此研究凍融是否對代謝組學檢測有影響就很重要。

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實驗設計

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圖1. 實驗設計


如上圖所示,作者選取了99個健康人的血清樣本,研究不同凍融次數(FTC)的影響。樣本保存于-80℃中,解凍的過程為在室溫下放置90分鐘使其完全解凍。第一次解凍結束后,每個樣本取出30μl作為FTC 1(F1)的樣本,將剩余的樣本重新放入-80℃冰箱保存。以上過程重復5次,即得到不同凍融次數的樣本F2-F5。

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結果

5次凍融實驗共得到495個樣本,將組內檢測率大于80%的peak保留,共檢測到2334個代謝物(本文中代謝物鑒定方法為three-tier approach)。

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多變量單變量分析

如下圖A所示,PCA分析中QC聚集的很好,可以說明儀器的穩定性很好。(大家可以看到QC在PCA的95%置信區間外,因此QC雖然是樣本的混合,會有向各組中心趨近的可能,但是不代表這樣的趨近一定是線性的,PCA展示的是多維空間的二維投影,在投影過程中產生偏離是十分正常的情況。)


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圖2. 5組樣本+QC的PCA圖

下圖A為五組樣本無QC的PCA得分圖,圖B為五組樣本的PLS-DA得分圖。在PCA圖中組間差異不明顯但是有監督的PLS-DA可以將組間差異清晰的展示出來,F1 (1次凍融) 和F2(2次凍融)與其他組有明顯的區分,圖B的置換檢驗結果也說明模型可靠。

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圖3. 5組樣本的PCA圖


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圖4. 5組樣本的PLS-DA圖及其置換檢驗結果

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單變量統計分析

作者使用p值和差異倍數(FC)作為差異物篩選的條件,p<0.05為具有顯著差異,選擇不同的FC倍數:1.2, 1.3, 1.4, 1.5為差異物篩選規則,篩選結果如下表1所示,我們可以看到F3, F4, F5比較篩選出的物質較少,所以這三組之間差異較小,與上面的多元統計分析一致,表明在凍融兩次之后,凍融對代謝物的影響變小。

另外,每次凍融都會導致代謝物發生變化,但是通過對這些物質的分析發現這些差異物之間沒有交集,那么我們無法預測凍融可能會對哪類物質產生顯著影響,因此若使用凍融樣本篩選出的差異物中很可能包括凍融導致的差異物。另外,根據不同的FC篩選出的物質數量及種類都不同,但是FC越大差異物越少,因此篩選規則中較小的FC會引入更高的假陽性。

表1. 兩兩對比的差異物篩選結果
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然后,作者分析了代謝物的濃度是否會隨著凍融次數有相同的改變模式。下圖A中展示了F2-F4與F1的比較中變化超過了50%的72個物質,很明顯這些物質的濃度并沒有隨著凍融次數的增加而逐漸變化,大部分物質的變化都是不規律的。如下圖B 的箱線圖所示,代謝物可以逐漸增加也可以逐漸減少,或者無規律的變化。因此,凍融對代謝物的影響是不同的。但是這種改變模式的原因是未知的,逐漸降低趨勢的原因可能是在凍融過程中發生了降解,逐漸升高趨勢的原因可能是凍融導致蛋白表面的物質被釋放或者由其他物質轉換而來,無規律變化模式的原因可能有多種影響因素。

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圖5. 72個物質在5組中的熱圖

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圖6. 不同差異物在五組中的變化模式

總的來說,作者發現凍融對血清代謝組學的影響很大,雖然在FC≥1.5的時候篩選出的差異物較少但是這也會為標志物的發現帶來很大的挑戰,尤其是當生物表型差異不會引起很大的代謝組學變化的時候,如下面要分析的性別因素。

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性別差異分析

本文中的樣本都來自健康人,其中最大的差別就是性別,99個樣本中包括47位男性和52位女性。下圖C,D展示了按性別分組后2D和3D的PLS-DA得分圖,在每個組中的男性和女性都有明顯的區分,尤其是F 1組中,這表明在有凍融效應的情況下性別區分依然存在,但是凍融效應可能會干擾性別相關標志物的發現。作者考慮了兩種在生物標志物發現過程中可能存在的情況。第一種是所有的樣本使用相同的凍融次數,第二種是樣本使用不同的凍融次數。

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圖7. 5組樣本按照性別分組后的2D, 3D-PLS-DA圖

對于第一種情況,作者使用兩兩比較的方法去分析數據。表2列出了以FC≥1.5和p<0.05篩選出的差異物,可以看到當凍融次數增加時,男性-女性之間的差異物數量并沒有顯著增加,這表明凍融效應不偏向男性或女性。

表2. 不同凍融次數的兩兩對比差異物篩選
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在不同性別-相同凍融次數的5次比較中,有11個物質是一直存在的,可以被看作性別區分的標志物,如下圖所示。No.238和No.473是11個物質中區分性別最顯著的物質,但是沒有被準確鑒定出來(鑒定方法為three-tier approach)。No.238可被認為是GABA的同分異構體(二級鑒定),No.473可被匹配為肌肽的衍生物(三級鑒定),有研究表明GABA和肌肽在男性中的含量比女性中的高,與本文的研究一致。

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圖8. 11個差異物在男性-女性組中的變化箱線圖

作者使用隨機森林的方法檢測這兩個標志物在F1組中的區分能力,結果如下圖所示,AUC的面積為0.978,然后應用于F2-F5組中,區分準確度隨著凍融次數保持穩定,因此凍融效應并不影響相同凍融次數的標志物發現,圖C, D中看到這兩個物質的濃度是相似的,因此無論凍融次數是多少都可以發現這兩個性別區分標志物。

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圖9. 性別標志物在F1組中的ROC分析(A)及其他組性別區分的準確度(B)。No.473(C)和No.238(D)在組件的濃度變化箱線圖

第二種情況中樣本使用不同凍融次數的情況是比較常見的,尤其是當大樣本量研究需要分為幾個batch的時候。下表展示了不同凍融次數的組間比較結果,結果表明當兩組樣本用不同的凍融次數處理時凍融效應會有明顯的增強。

表3. 不同凍融次數的兩兩對比差異物篩選
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作者分析了在不同凍融次數的組中發生顯著變化的差異物。下圖A展示了No.1286的變化, F1中男性組的濃度高于女性組,當男性組和女性組樣本經歷了相同的凍融次數,男性組中物質濃度都相應的增高,男女差異一直都存在。但是當比較F1-M和F2-F的時候差異很明顯的減小了,我們使用FC≥1.5去篩選性別標志物這個物質就被漏掉了,導致假陰性。另一方面,當F1-F和F2-M一起分析的時候,性別差異就會被放大,這種情況可能會導致結果的假陽性。因為我們無法預測代謝物在凍融時的變化模式,因此我們沒辦法發現標志物篩選過程中出現的假陽性和假陰性。

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圖10. No.1286在不同組間的濃度變化箱線圖

在標志物發現的過程中,假陽性會導致錯誤的標志候選物,假陰性會減小真正的標志物發現的機會。當樣本被分為不同的batch后,凍融次數是一個必須要考慮的因素。如果生物表型差異和凍融效應相似時(下圖B),凍融次數就會導致假陽性或假陰性的結果,但是當生物表型差異遠大于凍融效應時(下圖C),真正的差異物仍然可以被發現。

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圖11. 凍融效應和相對弱(B)/ 強(C)的表型效應之間相互作用的示意圖

在我們的研究中,真實情況遠遠比上述兩種情況要復雜,關鍵的問題在于我們如何檢測凍融效應是否會對發現標志物有顯著影響。作者提供了一個檢測凍融效應的方法,但是增加了很多工作量及時間,感興趣的各位可以看看附件。

那么,我們從這篇文章中可以學習到什么呢?

1.雖然文章中用到的是血清,但是我們已經知道凍融是會對代謝物有影響的,因此代謝組學的所有樣本在保存期間都要避免反復凍融,可將樣本分裝在離心管或其他容器中;

2.如果代謝物提取方法為凍融法,則需要確定凍融次數以保證盡可能多的提取出代謝物,因為文章中凍融5次后仍然可以提取出代謝物,那么樣本中可能還有未被提取的物質;

3.凍融法提取代謝物時不同batch或者group的樣本需要使用相同的凍融次數(小編覺得大家肯定都不會這么做的哈哈哈);

4.如果大家不太清楚哪些樣本需要注意哪些點,可以聯系BIOTREE的駐地工程師或公眾號后臺留言:“樣本+姓名+單位+電話”索取代謝組學樣本收集參考方法。

參考文獻:
Deying Chen, Wei Han, Huan Tao, et al. Effects of Freeze-Thaw Cycles of Blood Samples on High-Coverage Quantitative Metabolomics.Analytical Chemistry. 2020 Jun 15. 

文獻下載:
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