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文獻分享 | 缺氧或可通過改變腸道微生物群誘導骨髓間充質干細胞衰老

分類:行業資訊   發布時間 2020-06-22   閱讀: 1510

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阜外醫院:Xing J, Ying Y, Mao C, et al. Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells via altered gut microbiota. Nature Communications 2018; 9(1): 2020. IF=12.353
課題方向:缺氧-腸道菌群-骨髓間充質干細胞的衰老
組學平臺:GC-TOF/MS(骨髓上清);16s(糞便);宏基因組(糞便);分子生物學(WB/MTT等)
分組情況:non-CCHD (NCy);CCHD (Cy) 
分析圖:氣泡圖等

系統性慢性缺氧是一種與全身供氧不足相關的病理狀態,是許多疾病的特征。紫紺型先天性心臟病(CCHD)、慢性阻塞性疾病等許多疾病患者都會經歷慢性缺氧過程。CCHD患者表現骨髓間充質干細胞(BMSCs)過早衰老和D-半乳糖(D-galactose)異常積聚。

越來越多的證據表明腸道與骨髓(BM)之間存在通訊。慢性深度缺氧可以改變腸道微生物群的多樣性,并導致腸道微生物群衍生的代謝物的積累,這可能顯著影響宿主的體內平衡。作者采集了90名接受開胸心臟手術的幼兒患者【NCy(non-CCHD),Cy(CCHD),樣本具體信息見表1】胸骨骨髓和腸道糞便樣本,通過常規基礎實驗、16SrDNA測序、宏基因組測序、代謝組學檢測和動物模型試驗來研究慢性缺氧與骨髓及腸道微生物群的關系。
          
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表1 樣本信息

1 CCHD患者的缺氧及早衰情況研究

1.1 血氣分析

與NCy組相比,Cy組骨髓與外周動脈血的氧分壓與氧飽和度均顯著降低(表2)。
       
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表2 外周動脈與骨髓血氣分析

1.2 CCHD患者的BMSCs出現早衰

Cy組與NCy組的BMSCs分離培養(n = 5 每組)后分別進行western blot analysis、MTT assay、SA-β-gal analysis、及FACS analysis。結果發現Cy組中早衰標記蛋白(p16)表達量顯著升高(Fig. 1a);活細胞數顯著降低(Fig. 1a),表明細胞生長更緩慢;半乳糖苷酶陽性細胞數顯著增多(Fig. 1c);處于G0和G1期的細胞明顯增多,而S與G2/M期細胞減少 (Fig. 1d)。

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圖1 來自CCHD患者的BMSCs易于過早衰老

2 代謝組學研究

通過GC-TOF/MS平臺對Cy與NCy組中BM進行代謝組學研究(n = 20 每組),發現嚴重缺氧改變了BM的代謝譜。CCHD(Cy)患者與對照組(NCy)的差異代謝物主要富集在糖酵解、糖異生、TCA循環和半乳糖代謝途徑(Fig. 2a),這些途徑分別涉及糖代謝和氨基酸代謝;D-半乳糖可以通過產生大量活性氧(ROS)來誘導衰老,經檢測發現CCHD患者外周血(n = 22 每組)和骨髓(n = 5 每組)的半乳糖含量增加(Fig. 2b),同時BMSCs中ROS升高(Fig. 2c)。

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圖2 深度缺氧改變了骨髓代謝

3 半乳糖和氧條件控制下培養的BMSCs早衰情況的研究

分離NCy組的BMSCs,用不同氧條件(Hypo-:4% or Nor-:21%)與D-半乳糖濃度(N-:50 μg/ml or H-:90 μg/ml)進行培養后分別進行western blot analysis、MTT assay、SA-β-gal analysis、ROS 檢測以及FACS analysis。與其他3組相比,Hypo-H-Gal 組中早衰標記蛋白(p16)表達量明顯增加(Fig. 3a) ,細胞增長顯著降低(Fig. 4b),半乳糖苷酶陽性細胞數顯著增多(Fig. 3c),ROS顯著增加(Fig. 3e),更多細胞處于G0和G1期(Fig. 3d),表明低氧和過量半乳糖同時出現可導致BMSCs早衰。

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圖3 D-半乳糖的累積和缺氧導致BMSCs早衰

4 腸菌16SrDNA與宏基因組測序

通過對受試者的糞便進行16SrDNA與宏基因組測序(n = 20 每組),發現CCHD患者腸道菌群中乳桿菌、腸桿菌科、毛螺菌屬、疣微菌科、糞桿菌屬等含量減少(Fig. 4f);3種半乳糖降解酶【lactase (LCT), aldose 1-epimerase, GALE (UDP-glucose 4- epimerase)】含量顯著降低(Fig. 4g);同時糞便中乳桿菌含量與血液中半乳糖含量成負相關(Fig. 4h)。

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圖4 深度缺氧導致腸道微生物群紊亂

5 缺氧與乳酸菌對BMSCs的影響

5.1缺氧大鼠BMSCs早衰情況

新生Sprague-Dawley 大鼠隨機分成低氧組(Hypoxia)與對照組(Normal)(n = 9 每組),分別于10% O2或正?諝庵酗曫B3周,并進行血液半乳糖含量與糞便乳酸菌水平測定、早衰標記蛋白與肝臟中半乳糖代謝相關酶的western blot analysis。結果表明缺氧導致大鼠半乳糖含量顯著升高(Fig. 5a),乳酸菌含量顯著降低(Fig. 5b),早衰標記蛋白(p16)表達量顯著升高(Fig. 5c),半乳糖降解酶(GALK1)表達量顯著降低(Fig. 5d),這與CCHD樣本的檢測結果一致。

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圖5 大鼠慢性缺氧模型中D-半乳糖累積和BMSCs功能障礙

5.2 乳酸菌緩解BMSCs缺陷

新生雄性Sprague-Dawley 大鼠隨機分成4組(n = 9 每組),其中2組(Hypoxia)于10% O2空氣中飼養3周,而另2組(Normal)于正?諝庵酗曫B3周,并在最后一周對低氧與正常氧中各1組每天灌胃乳酸菌:Lactobacillus casei CRL431(+),另1組灌胃鹽水(-),之后分別進行早衰標記蛋白的western blot analysis、糞便乳酸菌的real-time qPCR analysis、半乳糖含量及腸道乳糖酶(LCT)活性的測定、腸組織H&E 染色、MTT assay、SA-β-gal analysis、以及FACS analysis。無論正常飼養還是缺氧飼養,灌服乳酸菌的大鼠糞便樣本中乳酸菌含量增加(Fig. 6a) ,外周血中半乳糖含量降低(Fig. 6b),G0和G1期細胞減少(Fig. 6h);相對于缺氧未灌服乳酸菌組,灌服乳酸菌組活細胞數增加,半乳糖苷酶陽性細胞數明顯降低(Fig. 6g),早衰標記蛋白(p16)表達量明顯降低(Fig. 6e);LCT活性在4組中未發生明顯變化(Fig. 6d);缺氧導致腸絨毛萎縮,補充乳酸菌后未有改善(Fig. 6c)。腸道微生物群落的改變可能是BMSCs缺陷的主要原因。而補充乳酸菌可緩解大鼠BMSCs衰老、細胞不良增殖以及細胞周期阻滯。

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圖6 大鼠缺氧模型中通過補充乳酸桿菌恢復缺乏的BMSCs功能

結論:
1. CCHD患者所經歷的慢性深度缺氧會對骨髓基質干細胞產生不良影響;
2. CCHD患者經歷的缺氧導致腸道微生物群落的多樣性改變,乳桿菌數量顯著減少,降解D-半乳糖的酶減少;
3. 血液和BM中過量的D-半乳糖通過ROS的累積可誘導BMSCs過早衰老;
4. 在大鼠模型中補充乳酸桿菌可以降低D-半乳糖積累、恢復缺氧大鼠模型中缺乏的BMSCs的功能。

參考文獻:
Xing J, Ying Y, Mao C, et al. Hypoxia induces senescence of bone marrow mesenchymal stem cells via altered gut microbiota. Nat Commun 2018; 9(1): 2020.

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