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文獻分享 | 腸菌代謝再添“新”明星——PAGln

分類:行業資訊   發布時間 2020-04-14   閱讀: 2107

腸菌這個瓜,科研人員吃不飽;代謝這個梗,小編更玩不膩;兩者一結合,簡直是王炸,必然是CNS?,因為每次都有新發現,每次都有新感覺。這不,2020年3月5日,腸道菌群通過代謝影響疾病再添新成員,還不快來跟小編一起吃瓜聊梗。

代謝組學
心血管疾病(CVD)相關的腸道菌群代謝物通過腎上腺素能受體發揮作用

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研究背景

心血管疾。–VD)是西方國家死亡率較高的疾病之一,而2型糖尿。═2DM)患者罹患心血管疾病及其重大不良心臟事件(major adverse cardiac events,MACE)的風險明顯較高,包括心肌梗塞、中風或死亡,單純使用控制血糖的藥物并不能有效降低CVD或者MACE風險,這表明,T2DM可能通過其他代謝途徑影響CVD風險。

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研究結果

1.非靶標代謝組學證實PAGln與CVD有關

首先,作者對初始發現隊列1162個受試者血漿樣本進行非靶標代謝組學分析,結果顯示:與MACE預測相關的候選代謝物中,已知結構的代謝物如氧化三甲胺(TMAO)、三甲基賴氨酸(TML)已經有文獻報導與腸菌代謝和心血管疾病風險有關。然而,其中未知化合物m/z 265.1188在(3年)MACE風險的危險比(HR)為95%(圖1A和1B)。隨后作者通過多種方法確證該物質為苯乙酰谷氨酰胺PAGln(圖1C)。

接下來,作者對獨立驗證隊列4000個受試者血漿樣本進行靶標代謝組學分析,結果顯示T2MD患者血漿中PAGln水平較高(與非糖尿病患者相比,P=0.0002),以及MACE患者之間血漿中PAGln水平也較高(與非MACE患者相比,P<0.0001);Kaplan-Meier生存分析表明PAGln水平高的受試者發生MACE風險更大(3年)(圖1D);此外,在調整傳統心臟危險因素后,較高的PAGln水平仍然是MACE風險的獨立預測因子(圖1E)。

代謝組學
圖1.非靶標代謝組學研究發現,m/z為265.1188的代謝物與心血管疾病風險相關,隨后被鑒定為苯乙酰谷氨酰胺

2.腸道菌群參與體內苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)和苯乙酰甘氨酸(PAGly)的形成

通過分析比較人類未服用抗生素(Pre-Abx)、服用抗生素7天(Abx)和停用抗生素大于3周(Post-Abx)后血漿中PAGln濃度,從而確立腸道菌群對PAGln生成的貢獻(圖2A)。作者通過對比人類和小鼠實驗結果,發現口服抗生素混合物處理前后,人類血漿中PAGln含量水平比PAGly高出一個數量。相比之下,小鼠的PAGly水平比PAGln高一個數量級,經腹腔注射的PAA主要代謝為PAGly,腸道菌群是PAA形成PAGly的關鍵參與者(圖2B-D)。因此,在人類和小鼠中,PAGln和PAGly在體內都是通過代謝途徑產生的,在這種途徑中,膳食中的Phe被腸道菌群轉化為PAA,在這一點上,宿主與Gln(人類首選)或Gly(嚙齒動物首選)發生接合反應,分別產生PAGln和PAGly(圖2E)。

代謝組學
圖2.PAGln在人體和小鼠體內的產生是一個依賴腸道菌群的過程

3.PAGln增強血小板刺激誘導的鈣釋放和對多種激動劑的反應性

之前結果(圖1)表明PAGln對血小板功能及與血管基質的相互作用有潛在影響。因此,作者進一步研究了PAGln是否在生理剪切力下影響全血中血小板與膠原表面的粘附。結果顯示:PAGln能夠提高膠原蛋白依賴性血小板粘附和擴散的速度(圖3A-3C),還呈劑量依賴性地增強血小板聚集的程度(圖3D)。PAGln還可劑量依賴性地增強血小板對ADP的反應(圖3E)以及對糖蛋白ɑ2β3(GP IIb/IIIa)的激活(圖3F)。進一步實驗驗證表明,單獨用PAGln預孵育血小板對基線[Ca2+]水平沒有影響(圖3G,左)。然而,暴露于生理水平的PAGln可劑量依賴性地增強次極量(0.02U)凝血酶引起的[Ca2+]升高(圖3G)。以上數據表明,腸道菌群依賴性代謝產物PAGln和PAGly顯著影響血小板功能,增強血小板與膠原基質的黏附,增強血小板刺激依賴性的[Ca2+]升高和對激動劑的聚集反應。

代謝組學
圖3.PAGln增強血小板反應性

4.PAGln促進血小板凝塊形成并增強體內血栓形成潛能

PAGln和PAGly對體內血栓形成的影響采用FeCl3誘導的頸動脈損傷模型,這是一種常用的誘導血栓形成的實驗方法。腹腔注射PAGln或PAGly后,PAGln或PAGly分別顯著升高。對小鼠的注射(圖S3A),以及頸動脈損傷后血小板凝固率和頸動脈內血流停止時間進行了量化。值得注意的是,PAGln和PAGly各自都誘導受損頸動脈內血小板血栓形成增加(圖4A),與營養前體Phe或生理鹽水(載體)治療的小鼠相比,損傷后停止血流的時間(即阻斷時間)相應減少(圖4B)。

5.腸道菌群基因porAfldH在體內調節宿主血栓形成潛能

接下來,作者測試了在宿主內促進PAGln/PAGly生成的共生體和基因是否可以調節體內的血小板功能和血栓形成潛力。文獻報道Phe主要由產孢梭菌(C. sporogenes)代謝為PAA和苯丙酸(PPA),其中參與反應的酶主要由porAfldH基因編碼。于是作者構建缺乏porAfldH基因功能的產孢梭菌突變株,結果發現,同時具有功能性porAfldH基因的(ΔcutC)產孢梭菌只產生同位素標記的PPA而不產生PAA,ΔcutCΔfldH突變體(仍然具有功能性PorA) 不再產生PPA,但確實產生了PAA(圖4C)。相反,(ΔcutCΔporA)產孢梭菌突變體(仍具有功能性fldH)不再產生PAA,而只產生PPA。正如體外培養數據(圖4C)所預測的那樣,(ΔcutCΔfldH)產孢子菌在GF小鼠中的定植導致PAGly水平顯著高于(ΔcutC)產孢子菌定植的小鼠(圖4D)(p<0.001)。動脈損傷后,在帶有(ΔcutCΔfldH)產孢梭菌突變體的小鼠中,血栓生成率和受損血管內血流停止的時間都顯著降低,產生更高水平的PAA,從而產生更高水平的PAGly(圖4D)。

圖4.PAGln和PAGly增強體內血栓形成潛能

6.PAGln顯示與細胞的飽和和特異性結合,提示具有特異性的受體-配體結合作用

為了驗證PAGln是否顯示出與細胞受體結合,作者使用動態質量重分布(DMR)技術實時檢測活細胞中依賴配體的整合細胞反應。對人骨髓來源的巨核細胞(MEG01)潛在結合配體(PAGln與Norepi與Phe)濃度增加的檢測表明,DMR劑量-反應曲線是飽和的和特異的,這是配體受體與PAGln和Norepi相互作用的典型過程,但不是Phe的典型相互作用過程(圖5A)。在平行研究中,PAGln與人骨髓來源的紅白血病細胞(HEL92.1.7)結合后,也觀察到飽和和特異的DMR劑量反應信號。

7.PAGln通過G蛋白偶聯受體介導細胞事件

通過聯合使用所有三種調節劑(PTX、CTX和YM-254890)或使用全局GPCR抑制劑SCH-202676,可以顯著降低PAGln誘導的DMR反應,這強烈表明GPCR參與了細胞對PAGln的反應(圖5B,左)。此外,用甲氨蝶呤或環磷酰胺預處理細胞,但不用YM-254890預處理,可顯著抑制PAGn誘導的DMR反應,提示GAI/O和GAS參與其中(圖5B,左)。此外,對Norepi的DMR響應的檢查顯示,與每一種已知的GPCR調節劑孵育時,DMR信號顯著減少(圖5B,中間)。相反,含有膠原的DMR信號(陰性對照)不受細胞對每個已知GPCR調節劑的預處理的影響(圖5B,右)。進一步檢測細胞內cAMP或[Ca2+]變化,發現PAGln確實引起了MEG01細胞(圖5C)和分離的人血小板(圖5D)中cAMP短暫(5分鐘內)顯著性的增加(約20%-30%),此外,用已知的GPCR調節劑預處理顯示CTX或GPCR抑制劑SCH202676抑制PAGln誘發的cAMP生成,提示PAGln暴露觸發了Gαs介導的腺苷酸環化酶的激活。

代謝組學
圖5.PAGln通過G蛋白偶聯受體和ADRs介導細胞反應

8.腸道菌群依賴的代謝物PAGln通過ADRs發揮作用

盡管人類基因組內存在800多種不同的GPCR,但作者注意到PAGln與兒茶酚胺的結構有些相似,兒茶酚胺已知與大型多基因ADR家族結合(圖5E)。值得注意的是,α2A,β2B和β2 ADRs這三種ADR的每一種siRNA在PAGln誘導的MEG01細胞中的DMR反應中都顯示出顯著的降低,而對照siRNA沒有任何影響(圖5F)。三種抑制劑均可顯著降低PAGln與MEG01細胞孵育所誘導的DMR反應,而單獨使用抑制劑不影響DMR反應(圖5G)。最后,ICI118,551和普萘洛爾,而不是RX821002,可以抑制PAGln(5分鐘暴露)誘導的MEG01細胞(圖5H)。因此,在多種細胞類型中采用遺傳學或藥理學方法進行的功能喪失和功能獲得研究證實,PAGln可以通過α2A,β2B和β2 ADRs誘導細胞反應。

9.功能獲得研究證實PAGln可以通過α2A,β2B和β2 ADRs發出信號

為進一步證實PAGln通過ADRs發揮功能的能力,作者通過在人胚腎細胞(HEK293)中分別過表達α2A,β2B和β2 ADRs進行了功能增益研究,選擇這些細胞是因為它們的內源性ADR密度相對較低。當親本或空載體(EV)轉染的HEK293細胞與PAGln共同孵育時,PAGln誘導的DMR反應在瞬時轉染ADRA2A基因(α2A-HEK293)或穩定轉染ADRA2B基因(β2B-HEK293)或穩定轉染ADRA2B基因(β2-HEK293)的HEK293細胞中觀察到增強的PAGln誘導的DMR反應(圖6A)。在補充功能獲得研究中,作者分析了PAGln對cAMP水平的影響。值得注意的是,親本HEK293細胞沒有顯示PAGln誘導的細胞內cAMP水平的變化(綠線),而b2-HEK293細胞顯示PAGln誘導的胞漿cAMP水平顯著增加(藍線)(圖6B)。

10.選擇性ADR抑制劑降低PAGln誘導的血小板高反應性和體內血栓形成速度

上述研究表明,ADR阻滯劑在CVD中的一些潛在益處可能來自于拮抗PAGln誘導的效應。與此一致,作者觀察到從低PAGln水平的健康志愿者中恢復的PRP暴露于病理生理相關水平的PAGln增強了亞極量ADP刺激的血小板聚集反應。同時,在普萘洛爾、ICI118,551或RX821002存在的情況下暴露PAGln可減弱PAGln誘導的血小板高反應性(圖6C)。此外,兩種ADR抑制劑都沒有對亞極量ADP刺激的血小板聚集反應產生直接影響(但取消了PAGln增加的血小板聚集反應;圖6C)。因此,每種ADR抑制劑的加入都逆轉了PAGln引起的血小板高反應性。

在最后一系列研究中,作者檢驗了臨床上廣泛使用的b-受體阻滯劑卡維地洛對PAGln誘導的體內血栓形成增強的影響。研究如前所述(圖4),檢查PAGln對FeCl3誘導的動脈損傷、血小板血栓形成率和血管閉塞時間的影響。值得注意的是,在沒有β-受體阻滯劑治療的情況下,PAGln再次顯著加快了血小板血栓形成的速度(圖6D),并縮短了血流停止的時間(圖6E)。雖然僅用卡維地洛治療小鼠對體內血栓生成速率或動脈損傷后停止血流的時間沒有影響(圖6E),但卡維地洛可逆轉PAGln的促血栓作用(圖6D和6E)。

代謝組學
圖6.PAGln通過ADRs調節血小板功能和體內血栓形成潛能

3
小結

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