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Blood:腸道微生物代謝物氧化三甲胺通過誘導M1巨噬細胞極化加重GVHD

分類:行業資訊   發布時間 2020-07-21   閱讀: 1861

代謝組學
文獻ID:Gut microbial metabolite trimethylamine N-oxide aggravates GVHD by inducing M1 macrophage polarization in mice
發表期刊:Blood
發表日期:2020-04-14
影響因子:16.562
通訊作者及單位:復旦大學華山醫院的陳彤團隊和復旦大學附屬婦產科醫院姜樺團隊
關鍵詞:氧化三甲胺(TMAO);腸道菌群;GVHD;膽堿飲食

導讀
短鏈脂肪酸和吲哚被證明可以降低移植物抗宿主。℅VHD)的嚴重程度,但人類腸道菌群的多樣性決定微生物代謝產物的多樣化,可能對GVHD的影響具有差異性。來自復旦大學華山醫院的陳彤團隊和復旦大學附屬婦產科醫院姜樺團隊近期發表在《Blood》上的文章顯示,腸道微生物代謝產物TMAO通過NLRP3依賴的機制誘導M1巨噬細胞的極化,進而增強Th1和Th17的分化,加劇小鼠GVHD的嚴重程度。文章揭示出宿主膽堿飲食、微生物代謝產物和GVHD之間的聯系,提示通過控制膽堿飲食或是減輕GVHD的有效策略。

01
摘要

①氧化三甲胺(TMAO)或高膽堿飲食加劇同種異體的移植物抗宿主。℅VHD),而膽堿類似物3,3-二甲基-1-丁醇可逆轉TMAO引起的GVHD嚴重性;
②在GVHD小鼠體內觀察到TMAO誘導的同種異體T細胞增殖和分化為T輔助亞型,但體外培養中未發現;
③TMAO通過增強NK-kB的核定位誘導NLRP3表達,通過線粒體的ROS激活NLRP3,從而在體內和體外誘導巨噬細胞的M1極化;
④在使用TMAO的情況下,GVHD小鼠體內NLRP3的缺失不僅阻斷了M1極化,且逆轉了GVHD的嚴重性。

02
背景介紹

嚴重的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)使異源造血干細胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)的應用受到限制,這是導致非復發死亡(non-relapse mortality, NRM)的主要原因。異體HSCT的調理方案引起宿主組織損傷,激活宿主抗原提呈細胞(antigen presenting cells, APC),主要包括巨噬細胞和樹突狀細胞,將宿主抗原呈給供體T細胞,產生T細胞刺激細胞因子。擴張的同種異體T細胞反過來攻擊宿主器官,包括皮膚、肝臟、腸道和造血系統,導致器官損傷和功能失調。

腸道微生物代謝物已被報道引發炎癥反應及炎癥相關疾病。腸道菌群組成的變化與病理過程有關,其中腸道菌群產生廣泛的生物活性代謝物可作為微生物對宿主影響的介質。

03
主要結果

1.TMAO可加劇GVHD小鼠的嚴重性和死亡率

構建小鼠模型確定TAMO飲食干預是否會影響GVHD的嚴重程度。

代謝組學
Figure 1. TMAO aggravated the severity and mortality of GVHD mice. 

(A)受體小鼠給予TMAO,使血清TMAO升高; 
(B)與TCD-BM 受體相比,TCD-BM+T (GVHD)受體血清氧化三甲胺(TMAO)濃度高于對照組;
(C~D)生存曲線表明TMAO治療的TCD-BM+T受體的存活率和GVHD評分明顯低于對照組;
(E~F)TMAO治療的GVHD小鼠出現較嚴重的GVHD靶組織損傷及組織學評分升高;

小結:TMAO加重了T細胞在異源性HSCT中誘導GVHD的嚴重程度。

2.DMB降低了高膽堿飲食產生的TMAO,減少了膽堿喂養的GVHD小鼠的組織損傷

構建小鼠模型評估高膽堿飲食對GVHD嚴重程度的影響及高膽堿飲食是否會改變GVHD小鼠的腸道菌群。

代謝組學
Figure 2. DMB decreased high choline diet-produced TMAO and reduced tissue damage in choline-fed GVHD mice.

(A)在飲用水中存在或不存在3,3-二甲基-1-丁醇(3,3-dimethyl-1-butanol, DMB)的情況下,給小鼠喂食對照飼料或膽堿補充飼料;
(B)膽堿飲食可顯著提高GVHD小鼠血清TMAO濃度,飲水中添加DMB可顯著降低血清TMAO濃度;
(C~D)補充膽堿飲食的TCD-BM+T組表現為生存曲線明顯縮短,GVHD評分升高?诜﨑MB降低了膽堿誘導的GVHD的嚴重程度。DMB在是否補充膽堿的情況下對GVHD的嚴重程度和生存曲線沒有顯著影響;
(E~F)膽堿喂養小鼠的內臟GVHD更加嚴重,表現為組織學評分升高,而添加DMB的飲用水可防止膽堿誘導的組織病理學損傷;
(G~H)高膽堿喂養的小鼠和對照組飲食喂養的小鼠的細菌多樣性和豐富度沒有顯著差異;
(I)九類腸道微生物群在膽堿飲食組表現為菌群效應量變化。

小結:膽堿飲食中GVHD嚴重程度的增加與氧化三甲胺的產生有關。

3.TMAO喂養的GVHD小鼠中發現Th1和Th17的分化,而在TMAO補充的體外培養體系中則沒有

探索TMAO誘導的GVHD惡化的潛在機制。

代謝組學
Figure 3. Th1 and Th17 differentiation was seen in TMAO-fed GVHD mice but not in TMAO-supplemented in vitro culture system.

(A)TMAO飲食干預及對照組小鼠造模;
(B)注入TCD-BM和T細胞的GVHD小鼠中,tdTomato+ T細胞(紅色)競爭性地歸巢到BM中,但減少了BM細胞移植;
(C)TMAO增強的T細胞浸潤通過體外免疫熒光圖像得到進一步證實;
(D)異基因受體脾臟tdTomato+ T細胞的出現頻率逐漸增加;
(E)TMAO處理的受體中IFN- γ、IL-17、t -bet、STAT4、STAT3和RORγt在tdTomato+ T細胞中表達上調,而IL-4和STAT6無變化;
(F)TMAO處理分離的CD4+和CD8+ T細胞,GVHD相關轉錄因子和細胞因子的表達均未發現表達。

小結:TMAO對誘導異基因T細胞擴張以及Th1和Th17反應的影響不是在體外培養系統中觀察的,而是在GVHD小鼠體內觀察的。

4.氧化三甲胺在體內和體外均可增強巨噬細胞浸潤并導致M1極化

從GVHD脾臟中篩選F4/80+CD11b+小鼠巨噬細胞和F4/80+CD11b+巨噬細胞中的CD16/32+ M1群體來研究巨噬細胞分化。

代謝組學
Figure 4. TMAO treatment enhanced macrophage infiltration and caused M1 polarization both in vitro and in vivo.

(A~B)與對照組相比,TMAO處理的GVHD小鼠的TCD-BM+T受體脾臟F4/80+CD11b+巨噬細胞顯著增加;
(C)TMAO飼養的GVHD小鼠中具有M1表型(F4/80+iNOS+)的F4/80+巨噬細胞浸潤更強;
(D~E)M1標志性細胞因子IL-6、CXCL9、CXCL10和IL-1細胞因子Nlrp3的表達在TMAO處理的GVHD小鼠脾F4/80+巨噬細胞中升高;
(F~G)TMAO刺激后,BMDMs中M1特征的IL-1β蛋白表達、IL-6、TNF-α, CXCL9和CXCL10的mRNA表達或蛋白生成均顯著增加。

小結:TMAO可以誘導巨噬細胞向M1表型極化。

5.TMAO通過激活NLRP3炎癥小體增強M1極化

M1極化的關鍵蛋白復合物NLRP3炎癥小體是否參與了BMDMs對TMAO的反應。

代謝組學
Figure 5. TMAO enhanced M1 polarization via activating NLRP3 inflammasome. 

(A)在TMAO刺激下,分散在對照靜息巨噬細胞內的ASC極化至核周區一側;
(B)在TMAO處理的BMDMs中,始終可以誘導IL-1細胞裂解,而膽堿對NLRP3的表達和IL-1細胞裂解沒有影響;
(C~F)NLRP3的抑制劑CY-09通過與NLRP3 NACHT結構域的ATP結合位點結合顯著抑制TMAO相關的caspase-1裂解的產生和極化以及IL-1分泌。
(G)CY-09抑制TMAO誘導的M1標志性細胞因子或趨化因子的mRNA表達,包括IL-1β, IL-6, TNF-α, CXCL9 and CXCL10。
(H)Nlrp3-/-BMDMs并未顯示M1表達增強,說明Nlrp3的激活在TMAO處理的巨噬細胞極化中起關鍵作用。

小結:NLRP3的激活在TMAO處理的巨噬細胞極化中起關鍵作用。

6.TMAO通過線粒體活性氧(ROS)激活NLRP3

線粒體功能障礙有助于NLRP3炎癥小體的激活,接下來研究了TMAO對線粒體功能障礙的作用。

代謝組學
Figure 6. TMAO activated NLRP3 via mitochondrial reactive oxygen species (ROS).

(A~C)免疫熒光和流式細胞儀分析顯示,TMAO處理后MitoSOX標記線粒體ROS增加;
(D)TMAO刺激導致JC-1紅色熒光強度降低,綠色熒光強度增加,表明TMAO處理后線粒體膜電位下降;
(E)TMAO刺激的BMDMs中觀察到功能失調線粒體的積累;
(F)NLRP3的產生卻沒有受到抑制;
(G~J)TMAO處理的巨噬細胞中,IL-1β蛋白和caspase1的產生被Mito-Tempo抑制;
(K~L)TMAO相關的M1巨噬細胞標志物細胞因子(TNF- a和IL-6)或趨化因子(CXCL9和CXCL10)的誘導被Mito-Tempo阻斷。

小結:TMAO相關的M1巨噬細胞標志物細胞因子(TNF- a和IL-6)或趨化因子(CXCL9和CXCL10)的誘導被Mito-Tempo阻斷。

7.NLRP3對于TMAO增強的GVHD是不可缺少的

進一步研究NLRP3在TMAO刺激的GVHD中的作用。

代謝組學
Figure 7. NLRP3 was indispensable for TMAO-enhanced GVHD.

(A)將缺乏NLRP3信號通路(NLRP3-/-)的小鼠作為受體進行小鼠建模;
(B)NLRP3的缺失顯著延長了GVHD小鼠的生存曲線;
(C)表明TMAO不能誘導M1巨噬細胞極化當Nlrp3缺乏;
(D~E)這一發現與Nlrp3-/-GVHD受者回腸、結腸、皮膚和肝臟組織的組織學評分不變相關。

小結:通過促進TMAO使NLRP3上調是通過 NF-κB核易位實現的。

04
文章延伸

氧化三甲胺及代謝物參與機體多種重要的生物學功能,如滲透調壓、穩定蛋白、防止蛋白變性、參與細胞分裂等。研究表明TMAO水平升高與心血管病呈現明顯正相關,與高血壓、心功能不全、動脈硬化等多種疾病密切相關,因此氧化三甲胺受到越來越廣泛關注。Biotree 氧化三甲胺及相關代謝物高通量靶標定量可同時對6種物質進行絕對定量檢測,有周期短、靈敏度高、定性定量準等特點。

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參考文獻:
Wu KP, et al. Gut microbial metabolite trimethylamine N-oxide aggravates GVHD by inducing M1 macrophage polarization in mice. Blood 2020, doi:10.1182/blood.2019003990

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