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文獻分享 | 糖酵解代謝酶Aldob介導肝癌代謝重編程

分類:行業資訊   發布時間 2020-09-10   閱讀: 1916

代謝重編程是癌癥的一個核心特征,但它在肝細胞癌(HCC)進程中仍缺乏明確的定義。之前的研究發現醛縮酶B(Aldolase B, Aldob)在肝癌組織中顯著下調并且其表達與預后不良呈負相關,而代謝重編程環境下Aldob丟失的潛在機制仍基本未知。2020年7月,中國科學院上海營養與健康研究所在國際期刊Nature Cancer上在線發表題為“Aldolase B Suppresses Hepatocellular Carcinogenesis by Inhibiting G6PD and Pentose Phosphate Pathways”文章,發現Aldob通過直接結合和抑制磷酸戊糖途徑中的限速酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)來抑制HCC,揭示了肝細胞癌中由于Aldob丟失而出現的一種新的代謝重編程模式,為肝癌治療提供了一種潛在的治療策略,下面來看看具體研究內容吧。


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研究人員首先對HCC病人組織進行基因芯片分析,發現除ALDOB外,大多數糖酵解和PPP基因在腫瘤和門靜脈腫瘤血栓(PVTT)組織中顯著上調,表明HCC代謝重編程。接著使用[U-13C6]葡萄糖跟蹤新鮮人體組織中的代謝通量,發現來自糖酵解、三羧酸(TCA)循環和PPP的代謝物在腫瘤和PVTT中顯著增加,并觀察到Aldob的階段依賴性下調和G6PD上調。在Kaplan-Meier分析中,Aldob高表達的患者比低表達的患者存活時間更長,而G6PD表達的患者則顯示相反的趨勢。此外,G6PD高表達、Aldob低表達患者具有最短的生存期,而G6PD低表達、Aldob高表達患者具有最長的生存期。進一步研究發現Aldob過表達抑制腫瘤細胞增殖,而Aldob敲除則促進腫瘤細胞增殖、葡萄糖消耗和乳酸生成。Aldob表達顯著影響G6PD活性、氧化PPP代謝、耗氧量、糖酵解速率和細胞遷移,而不影響G6PD蛋白表達。這些數據表明Aldob通過抑制G6PD活性和PPP代謝來抑制腫瘤生長,Aldob的丟失可能會導致HCC代謝重編程的新模式(圖1)。


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圖1 | Aldob下調和G6PD上調與HCC患者較差的生存和預后相關

接下來,作者通過將二乙基亞硝胺(DEN)注射到喂食無果糖飲食的Aldob基因敲除(KO)小鼠體內,研究Aldob的抑瘤作用。在第40周,Aldob-KO小鼠的肝臟/體重比顯著增加,腫瘤更多,腫瘤體積更大,腫瘤發病率高>5mm。非靶向代謝組學檢測分析發現WT和Aldob-KO小鼠的腫瘤組織具有不同的代謝模式,果糖代謝和PPP途徑受顯著影響。在Aldob KO小鼠中氧化性PPP代謝物6PG和R5P,而不是非氧化性PPP代謝物S7P和E4P顯著增加,與G6PD酶活性和GSH/氧化谷胱甘肽(GSSG)比率的增加一致。為了進一步支持肝臟Aldob的腫瘤抑制作用,作者在肝臟特異性KO(L-Aldob–/−)小鼠中通過腺相關病毒(Aldob AAV)恢復Aldob表達的研究發現與WT對照組小鼠(Aldobf/f+CK AAV)相比,肝臟特異性Aldob-KO對照組(L-Aldob–/−+CK-AAV)顯著增加肝臟/體積比、腫瘤數量、最大腫瘤體積和腫瘤發生率>5 mm,而Aldob恢復組(L-Aldob–/−+Aldob-AAV)則顯著抑制腫瘤生長和氧化PPP(6PG和R5P),此外,包括糖酵解、TCA和PPP在內的整個中心碳代謝也發生了顯著變化?傊,肝臟Aldob通過抑制G6PD和氧化PPP代謝發揮腫瘤抑制作用,而Aldob的丟失釋放G6PD以促進PPP代謝以維持腫瘤生長(圖2)。


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圖2 | Aldob通過調節肝細胞癌小鼠模型中G6PD活性和PPP代謝影響腫瘤發生

為了進一步支持通過Aldob的丟失釋放G6PD活性來促進PPP從而促進HCC的假設,作者接下來通過在L-Aldob–/−中基因敲除G6PD或在Aldob KO小鼠中通過藥物(G6PD抑制劑6-氨基煙酰胺(6AN)和脫氫表雄酮(DHEA))抑制G6PD活性來研究腫瘤的形成。分別與L-Aldob–/−對照組(L-Aldob–/−+ shNT AAV)和藥物處理對照組(KO+溶劑)相比,G6PD基因敲除L-Aldob–/−小鼠(L-Aldob–/−+shG6PD AAV)和藥物處理組(KO+抑制劑)均顯著降低了肝臟/體積比、腫瘤數量、最大腫瘤體積和Ki67陽性細胞百分比,G6PD活性、6PG和R5P水平、NADPH生成和GSH/GSSG比率均顯著降低。表明Aldob丟失誘導的G6PD和PPP代謝促進腫瘤發生,而抑制G6PD和PPP可減弱腫瘤發生(圖3)。


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圖3 |抑制G6PD減弱Aldob丟失誘導的腫瘤發生

作者利用免疫共沉淀、GST互作蛋白等實驗驗證Aldob結合并抑制G6PD活性,而Aldob的丟失有利于腫瘤形成這一假說,結果發現G6PD與Aldob具有直接的物理相互作用,而且Aldob結合和抑制G6PD的能力與Aldob酶活性無關。接著作者研究了Aldob–G6PD相互作用如何影響G6PD活性和細胞增殖,發現Aldob突變體幾乎完全破壞了Aldob-G6PD相互作用,挽救了細胞生長。在二琥珀;D移酶(DSS)交聯試驗中,Aldob敲除顯著增加活性G6PD二聚體的形成,表明Aldob丟失釋放G6PD活性的抑制?傊,Aldob通過直接與G6PD結合來抑制G6PD活性;Aldob-G6PD相互作用的中斷釋放G6PD活性以促進細胞增殖。此外,Aldob對G6PD的支架作用比其酶活性更重要(圖4)。


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圖4 |Aldob通過與G6PD直接作用和抑制G6PD酶活性來抑制HCC腫瘤的發生

基于先前的研究表明腫瘤抑癌基因p53直接結合并抑制G6PD活性以及在不同Aldob表達小鼠中G6PD酶活性變化不同,作者推測p53可能參與了Aldob介導的G6PD抑制。研究了這三種蛋白質之間的相互作用,發現這三種蛋白相互作用形成穩定的Aldob-G6PD-p53蛋白復合物,而且Aldob的表達還以劑量依賴的方式顯著增強了G6PD-p53的相互作用。接著作者研究了蛋白復合物對G6PD酶活性和細胞增殖的影響,發現單獨的Aldob或p53顯著增強了對G6PD活性和細胞增殖的抑制,而這兩種蛋白的存在則具有加性抑制作用,在Aldob突變體中G6PD–Aldob相互作用的完全中斷則恢復了G6PD活性和細胞增殖?傊,Aldob穩定了Aldob–G6PD–p53復合物,并增強了p53介導的G6PD和細胞增殖的抑制;Aldob的丟失或Aldob–G6PD相互作用的破壞導致Aldob–G6PD–p53復合物的不穩定性,并減弱了Aldob和p53對G6PD的抑制作用,導致PPP代謝上調,腫瘤的形成(圖5)。


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圖5 | Aldob通過穩定Aldob–G6PD–p53蛋白復合物抑制G6PD活性

作者使用幾種葡萄糖示蹤劑在不同的Aldob突變細胞中進行了代謝通量分析,研究Aldob如何通過Aldob–G6PD–p53復合物調節G6PD活性和PPP代謝。首先使用[1,2-13C2]葡萄糖來跟蹤糖酵解和PPP代謝的分配,發現****酸和乳酸的M+1同位素以及PPP/GM在Aldob過表達細胞中顯著降低,而在這三種Aldob突變細胞中不穩定的Aldob–G6PD–p53顯著逆轉了這些趨勢,表明Aldob通過Aldob/G6PD/p53抑制PPP氧化代謝。其次使用[3-2H]葡萄糖跟蹤代謝通量到PPP,基于不穩定氘通過G6PD轉移到NADPH。結果發現Aldob過表達顯著抑制了PPP代謝,而G6PD-Aldob相互作用的完全中斷則恢復了PPP代謝。再次使用[1-2H]葡萄糖來測量[2H]標記的NADPH,以反映G6PD活性和PPP代謝,因為G6PD催化[1-2H]G6P生成[2H]NADPH。Aldob過表達抑制了2H進入NADPH,而破壞Aldob–G6PD–p53相互作用完全恢復了2H進入NADPH中,這表明Aldob–G6PD–p53復合物的不穩定釋放了Aldob對G6PD活性的抑制。最后,使用[U-13C6]葡萄糖來檢測G6P、6PG和R5P的產生,發現Aldob過表達導致標記的G6P、6PG和R5P顯著減少,而在Aldob突變體中,這些影響減弱。作者通過原位腫瘤模型發現Aldob過表達顯著延長小鼠存活時間,而完全破壞Aldob–G6PD相互作用則存活時間較短。此外,Aldob表達抑制腫瘤生長、腫瘤大小、體積和重量,而阻斷Aldob–G6PD–p53相互作用可恢復相應的腫瘤變化?傊,Aldob通過與G6PD直接結合和穩定Aldob-G6PD-p53復合物,從而抑制G6PD活性和PPP代謝從而抑制腫瘤發生,顯示了一種新的腫瘤抑制作用(圖6)。


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圖6 | Aldob通過穩定Aldob–G6PD–p53復合物抑制PPP代謝和腫瘤生長

小結:正常肝細胞中有足夠的Aldob表達維持代謝穩態,并通過與G6PD和p53相互作用形成穩定的蛋白復合物(Aldob/G6PD/p53)來防止G6PD活性過度發揮。Aldob的丟失導致Aldob–G6PD–p53復合物的分解,釋放G6PD并增強PPP代謝,以滿足HCC進展的生物能量需求。研究揭示了肝內醛縮酶B(Aldob)在肝細胞癌糖代謝中起代謝開關的作用,因此,靶向Aldob介導的代謝重編程途徑可能是肝癌防治的一種潛在治療策略。

文章延伸

文章使用了代謝流示蹤技術研究了糖酵解代謝酶Aldob介導肝癌代謝重編程機制。BIOTREE提供靶標代謝流分析,為您的科學研究助力。

靶標代謝流分析(Metabolic Flux Analysis,MFA),通過向細胞中添加13C或者15N同位素標記的底物,使用質譜法測量下游代謝物中出現的同位素摻入模式,進行代謝流研究,可以得到標記底物在代謝網絡中的代謝流向和分布,能夠系統地定量細胞或者組織內特定代謝通路代謝網絡的流量分布及各代謝途徑的相對貢獻。


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Systems-level analysis of isotopic labeling in untargeted metabolomic data by X13CMS. Nature protocol, 2019

示蹤劑:如13C標記的Glucose,為代謝反應提供13C碳源 

被標記的代謝中間體:如Citrate,既可使用葡萄糖也可以使用谷氨酰胺作為碳源,如果葡萄糖被13C標記,通過追蹤同位素便可得知其對檸檬酸合成的貢獻

應用方向

通過比較不同環境條件及各種代謝性疾病的不同代謝途徑的代謝流量的分布變化,揭示出相關疾病發生發展過程中的主要代謝通路及其早期診斷的標志物;

通過13C代謝流量技術對胞內外的中間代謝物的變化示蹤,可以鑒定出基因工程菌的關鍵的代謝通路和活性,為提高目標代謝產物的合成提供直接的依據;

可以比較分析細胞、組織及其血樣和尿液在基因改造的前后的代謝功能變化。

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參考文獻:
Min Li, Xuxiao He,Weixing Guo,et al.Aldolase B suppresses hepatocellular carcinogenesis by inhibiting G6PD and pentose phosphate pathways. Nature Cancer,2020

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