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Science重磅發表蛋白質組黃金CP-深度TMT蛋白質組+磷酸化蛋白質組:機體晝夜節律調節因子的新發現

分類:行業資訊   發布時間 2020-09-15   閱讀: 1520


蛋白質組學


文獻ID:Circadian rhythms in the absence of the clock gene Bmal1
發表期刊:Science
發表日期:2020-02-14
影響因子:41.845
樣本類型:小鼠皮膚成纖維細胞(MSFs)、肝組織
樣本數量: 發現集(n=10),驗證集(n=10) 
主要技術:TMT-10plex標記蛋白質組、磷酸化蛋白質組、轉錄組
搜庫軟件:MaxQuant(version 1.5.2.8)

01
研究背景

晝夜節律(約24小時)在調節日常生理方面起著重要作用。轉錄因子Bmal1是哺乳動物生物鐘的主要驅動因子,是作為機體主要的分子計數器的關鍵部分。但美國賓夕法尼亞大學Akhilesh B. Reddy發現,通過深度TMT蛋白質組、磷酸化蛋白質組和轉錄組學研究,在Bmal1基因敲除小鼠中,即使沒有外界刺激(如光或溫度的變化),其也會影響身體的周期變化,預示著生物時鐘的其他驅動因素也是存在的。

02
研究成果

1.Bmal1基因敲除小鼠中的肝臟組織和成纖維細胞表現出晝夜節律性振蕩

作者使用糖皮質激素-地塞米松(DEX)同步小鼠肝臟組織和皮膚成纖維細胞(MSFs),然后同步48小時后在恒定條件下取樣。在Bmal1-/-的MSFs中檢測到了節律性表達基因。其在Bmal1-/-Bmal1+/+肝組織中具有相似的振幅分布。此外,觀察到振幅分布與使用野生型小鼠進行的早期晝夜轉錄組研究的振幅分布相當。正如所預期的,與兩種基因型的成纖維細胞相比,肝組織中節律性轉錄基因的振幅更高。 
蛋白質組學
圖1  Bmal1-/-小鼠肝組織和皮膚成纖維細胞的節律轉錄組

2.ETS轉錄因子、PRDX蛋白和通過Trp53和Sirt1介導的時鐘組成之間存在多重相互作用,它們是晝夜節律時鐘基因表達的重要調節因子

是什么潛在的分子機制驅動了大腦組織的晝夜節律性?為了研究這一點,作者分析了節律性表達轉錄基因的啟動子區(FDR < 0.1),無偏基序分析表明E26轉錄因子(ETS)和KLFs或特異性蛋白(Sp)轉錄因子基序分別在黎明和黃昏階段富集。發現了多個具有相似峰期的ETS轉錄因子的表達聚集在一起。此外,siRNA敲除PRDX蛋白也影響有核U2OS細胞的晝夜節律。
蛋白質組學
圖2  Bmal1-/-組織中ETS轉錄因子和PRDX蛋白的24小時節律性

3.MSFs和肝組織的深度TMT蛋白組磷酸化蛋白組聯合分析,揭示即使在沒有Bmal 1的情況下,翻譯后過程也是組織節律性的關鍵調節因子

據已有報道,野生型小鼠體內存在晝夜蛋白質組和磷酸蛋白質組,但是不在Bmal1-/-組織中,因而作者研究了這種節律性是否延伸到Bmal1-/-小鼠的蛋白質組和磷酸化蛋白質組水平。作者將MSFs和肝組織按照不同時間點(野生型組和Bmal1-/-組)進行標記,每種樣本類型分別用兩套TMT-10plex試劑盒將其分為發現集和驗證集。發現集包括十個偶數時間點(CT0、CT6、CT12、CT18、CT24、CT30、CT36、CT42、CT48、CT54),而交替的奇數時間點(CT3、CT9、CT15、CT21、CT27、CT33、CT39、CT45、CT51、CT57)在驗證集中進行分析。肽段處理過程中,10%的TMT標記的肽用于深度蛋白質組學分析,而其余90%進行磷酸化肽富集,用于磷酸化蛋白組實驗。使用TiO2進行磷酸化肽的富集。

在MSFs和肝組織的野生型組和Bmal1-/-組中,都檢測到了與節律相關的表達蛋白質和磷酸化修飾蛋白。在MSFs的野生型組中檢測到585個節律蛋白,Bmal1-/-組中檢測到364個節律蛋白,兩種基因型的蛋白節律峰相位相當。與節律性轉錄組結果相似,在野生型和Bmal1-/-細胞中發現的環狀蛋白和磷酸化修飾蛋白之間的重疊最小。正如預期,與節律相關的磷酸化蛋白振幅比兩種基因型的常規蛋白都高。
蛋白質組學
圖3  BMAL1缺失時的節律蛋白質組和磷酸化蛋白質組

4.與節律相關的轉錄基因和蛋白質在Bmal1敲除動物中的功能是多樣的

與野生型相比,Bmal1-/-顯著富集的生物過程包括代謝、細胞內轉運和氧化還原。此外,GO分析發現,特定的細胞成分過多,特別是線粒體及其不同的亞細胞。與這些觀察結果一致,有報道稱Bmal1功能對線粒體分裂、融合動力學和肝臟呼吸功能很重要。
蛋白質組學
圖4  在Bmal1-/-小鼠中線粒體GO條目的過表達

03
研究結論

盡管Bmal1對于24小時行為周期的表達是必需的,但是它對于轉錄、翻譯和翻譯后修飾蛋白水平的24小時分子節律不是必需的,翻譯后過程也是組織節律性的關鍵調節因子。

04
文章亮點

生物體的調控網絡非常復雜,單一組學的研究具有一定的局限性。蛋白組只能反映表達水平的物質變化,而蛋白翻譯后修飾(PTM)可以展示修飾水平的物質變化。只進行其中某一層面的檢測,不能真實地探究到底是表達還是修飾起到了關鍵的作用。所以深度TMT蛋白組和修飾蛋白組的聯合分析,可以實現更加全面,精準的研究目的。

05
文章延伸

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