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Nature | 穩定同位素追蹤(代謝流技術)揭示黑色素瘤治療新方向

分類:行業資訊   發布時間 2020-09-16   閱讀: 1982
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Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential
Nature. 2020 January ; 577(7788): 115–120. doi:10.1038/s41586-019-1847-2.

核心觀點

轉移需要腫瘤細胞經歷一系列代謝變化,我們對這些變化知之甚少
黑色素瘤細胞單羧酸轉運蛋白1(MCT1)的功能差異帶來代謝的差異,進一步賦予轉移潛能的差異
體內的穩定同位素追蹤(代謝流技術)檢測移植病人腫瘤揭示高效轉移黑色素瘤細胞和低效轉移黑色素瘤細胞間的營養利用差異
循環乳酸是高效轉移黑色素瘤細胞的重要乳酸來源
高效轉移黑色素瘤細胞的單羧酸轉運蛋白1水平更高
抑制單羧酸轉運蛋白1引起乳酸攝入的減少
抑制單羧酸轉運蛋白1對原發皮下腫瘤的生長影響不大
抑制單羧酸轉運蛋白1減少循環黑色素瘤細胞
抑制單羧酸轉運蛋白1減少移植病人腫瘤和小鼠黑色素瘤中的轉移疾病負擔
穩定同位素追蹤(代謝流技術)揭示抑制單羧酸轉運蛋白1抑制氧化戊糖磷酸通路
抑制單羧酸轉運蛋白1升高了氧化自由基(ROS)水平
抗氧化劑可以阻斷抑制單羧酸轉運蛋白1對轉移的影響
靜脈注射相同黑色素瘤來源的單羧酸轉運蛋白1高表達細胞,生成轉移腫瘤的能力更強
黑色素瘤細胞依賴單羧酸轉運蛋白1管理氧化應激的代謝差異賦予轉移潛能的差異

背景知識

轉移是一個非常低效的過程,其中很少癌細胞能生存下來。限制某些癌癥(包括黑色素瘤)轉移的因素是氧化應激。黑色素瘤細胞在轉移過程中氧化應激增加,必須經歷代謝變化才能生存。依賴葉酸通路生成NADPH來對抗氧化應激。NADPH能再生谷胱甘肽(一種對抗氧化應激的緩沖劑)。谷胱甘肽和其他抗氧化劑促進癌癥的啟動和進展。這表明,親氧化療法將抑制一些癌癥的進展。

高糖酵解細胞排出乳酸以消除多余的酸和維持糖酵解。因此,乳酸一度被認為是一種廢物。事實上,一些癌細胞從培養基中攝入并代謝乳酸。腫瘤細胞通過單羧酸轉運蛋白1攝入循環系統中的乳酸,將其作為三羧酸 (TCA) 循環的碳源。乳酸運輸增強與更糟糕的疾病結果相關。乳酸消耗可能是更具侵略性的癌癥的生物標志。乳酸消耗可能促進癌癥進展。

乳酸主要通過單羧酸轉運蛋白1和單羧酸轉運蛋白4在細胞質膜上運輸。單羧酸轉運蛋白雙向、被動地運輸乳酸及相關單羧酸,包括****酸。盡管單羧酸轉運蛋白轉運多種羧酸,它在體內的主要生理功能是向內轉運乳酸,乳酸的轉運量至少是其他羧酸的十倍。單羧酸轉運蛋白的運輸方向取決于乳酸和質子濃度梯度。抑制單羧酸轉運蛋白1可以誘導細胞死亡,抑制糖酵解,并能抑制小鼠異種移植瘤生長和癌細胞遷移。然而,大多數對單羧酸轉運蛋白的研究是在體外進行的,體外培養的細胞往往比體內的糖酵解性高,單羧酸轉運蛋白是否調節體內的癌癥進展還不確定。

穩定同位素追蹤(代謝流技術)揭示體內高效轉移黑色素瘤攝入更多的乳酸

分別使用[U-13C]Glucose、[U-13C]Glutamine、[U-13C]Lactate、[2-2H]Lactate等穩定同位素標記的營養來源給小鼠靜脈注射,檢測腫瘤內部的代謝信息,發現高效轉移黑色素瘤細胞攝入更多的乳酸,乳酸進一步代謝進入TCA循環和生成蘋果酸。主導乳酸代謝的LDHA、LDHB蛋白在高效轉移黑色素瘤細胞和低效轉移黑色素瘤細胞中均有WB檢出。乳酸的碳原子供應TCA循環,同時通過NAD+/NADH為蘋果酸提供氫原子。
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圖一
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圖二

WB、流式細胞儀技術、免疫熒光染色技術揭示高效轉移黑色素瘤的單羧酸轉運蛋白1(負責乳酸的轉運)表達水平更高

使用HCC15野生型作為陽性對照、HCC15 MCT1 KO作為陰性對照,WB檢測發現在高效轉移的黑色素瘤細胞(M405、M481、UT10)中的MCT1表達水平較低效轉移的黑色素瘤細胞(M528、M597、M610)更高。流式細胞儀技術檢測同樣發現在高效轉移的黑色素瘤細胞(M405、M481、UT10)表面的MCT1表達水平較低效轉移的黑色素瘤細胞(M528、M597、M610)更高。免疫熒光染色實驗同樣證明高效轉移的黑色素瘤細胞的MCT1表達水平較低效轉移的黑色素瘤細胞更高。

加入單羧酸轉運蛋白1的抑制劑(AZD),高效轉移的黑色素瘤細胞(M405、M481、UT10)的乳酸的攝入顯著減少。
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圖三
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圖四

抑制單羧酸轉運蛋白1(MCT1)對原發皮下腫瘤的生長影響不大,但顯著減少循環黑色素瘤細胞數量、減少移植病人腫瘤和小鼠黑色素瘤的轉移負擔

使用AZD抑制MCT1,DMSO作為陰性對照。發現抑制MCT1對高轉移黑色素瘤(M405、M481、UT10)皮下腫瘤生長的影響不大,但顯著減少了循環黑色素瘤細胞的數量。使用帶熒光標記的細胞系(YUMM1.7、YUMM3.3、YUMM5.2)移植小鼠,同樣發現抑制MCT1對皮下腫瘤的生長影響不大,但顯著減少了轉移負擔。
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圖五

抑制單羧酸轉運蛋白1升高了氧化自由基(ROS)水平,抗氧化劑 (NAC) 可以阻斷抑制單羧酸轉運蛋白1對轉移的影響

使用AZD抑制MCT1,DMSO作為陰性對照。發現AZD顯著提升了腫瘤細胞的氧化自由基水平。同時,使用抗氧化劑(NAC)阻斷AZD的抑制作用。發現AZD和NAC對皮下腫瘤的生長沒有顯著影響,但NAC可以顯著減弱AZD抑制轉移的作用。小鼠的解剖結果很直觀的展示了AZD和NAC對黑色素瘤(UT10)轉移的影響。圖七中彩色的斑點為腫瘤細胞發出的熒光信號。AZD顯著抑制了腫瘤向腎臟、胰腺等器官的轉移,而NAC可以阻斷AZD的抑制作用。
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圖六
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圖七

穩定同位素追蹤(代謝流技術)揭示抑制單羧酸轉運蛋白1抑制氧化戊糖磷酸通路

使用[1,2-13C]Glucose穩定同位素標記,經過糖酵解生成的乳酸帶M+2標記,經過氧化戊糖磷酸通路生成的乳酸帶M+1的標記。比較M+1乳酸和M+2乳酸的比例即可知道戊糖磷酸通路和糖酵解的通量比例。使用AZD抑制MCT1,DMSO作為陰性對照。檢測關鍵的代謝物、M+1乳酸和M+2乳酸的比例的信息,發現AZD顯著抑制氧化戊糖磷酸通路、降低了NADH水平。
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圖八
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圖九

靜脈注射相同黑色素瘤來源的高單羧酸轉運蛋白1高表達細胞生成轉移腫瘤的能力更強

使用流式細胞儀分選同一腫瘤來源的高表達MCT1細胞和低表達MCT1細胞,移植到小鼠,發現高表達MCT1細胞的轉移能力更強。
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圖十

總結

研究者利用穩定同位素追蹤(代謝流技術)發現高轉移腫瘤和低轉移腫瘤對乳酸的攝入和利用差異。進一步發現乳酸的轉運蛋白–單羧酸轉運蛋白1(MCT1)的表達量差異。使用MCT1的抑制劑AZD,進行干預實驗,發現抑制MCT1造成的氧自由基(ROS)、糖酵解/氧化戊糖磷酸通路、轉移能力等一系列差異。進一步發現使用抗氧化劑NAC可以逆轉AZD對腫瘤轉移能力的抑制。最后通過小鼠的解剖實驗和同一腫瘤來源的高表達MCT1細胞和低表達MCT1細胞的轉移能力比較證實:黑色素瘤細胞依賴單羧酸轉運蛋白1管理氧化應激的代謝差異賦予轉移潛能的差異。

穩定同位素追蹤(代謝流技術)儼然已經成為腫瘤和免疫研究領域的標準配置。
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