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【Plant Physiology】101種植物激素絕對定量的方法是怎么做到的?

分類:行業資訊   發布時間 2020-10-16   閱讀: 2016

植物激素是一種具有重要生理作用的小分子,在調節植物各種生理過程的復雜信號網絡中起著重要作用,一般來說,它們在植物組織中的濃度非常低,如何準確定量地檢測植物激素便成了大家關注的焦點。

今天給大家分享一篇發表在 Plant Physiology上的文章:Plant Hormonomics: Multiple Phytohormone Profiling by Targeted Metabolomics。這篇文章詳細介紹了101種植物激素絕對定量的方法。希望本文的分享能夠給大家帶來些許啟發。


代謝組學


01
樣本處理

文章采用一步提取法結合SPE固相萃取柱前處理方法,結合HPLC-ESI-MS/MS方法正負模式共測定101種植物激素,作者研究了油菜素內酯類物質在不同比例的乙腈中的溶解度(圖一A),同時在這些不同比例的乙腈中葉綠素a與葉綠素b的含量(圖一B),最終提取液選擇50 %乙腈溶液,作者同時測試不同分類待測物質在酸性與堿性條件下的穩定性來確定是否添加其他酸堿添加劑(圖一C),作者查詢了之前的文獻報道,為了降低基質效應的同時防止步驟過于繁瑣,作者選擇通過單個SPE固相萃取柱,具體樣本預處理過程見圖一D。



圖一 樣品制備的優化

02
色譜分離

本篇文章共分離101種植物激素,這些植物激素有許多是同分異構體,質譜檢測器無法分離,需要靠色譜使其基線分離,高效色譜柱當前更新速度較快,作者從中選取RP ultra-HPLC (UHPLC)配合charged-surface hybrid (CSH)保護柱與ethylene-bridged hybrid (BEH) polymer-based sub-2-μm sorbent色譜柱進行比較,通過IAA-Asp與IAA-Glu在兩根柱子上的峰形表現最終確定使用RP ultra-HPLC (UHPLC)配合charged-surface hybrid (CSH)保護柱(圖二A),作者根據以往的文獻得知隨著流動相中甲酸濃度的升高對CK類植物激素的物質分離有損害,作者用等度洗脫測試了甲酸濃度梯度為0.001 %,0.01 %與0.1 %,最終選用甲酸濃度為0.01 %作為流動相,它的色譜圖見圖二B,作者經過測試,如果采用正負切換模式,負離子的響應會降低4-12倍,所以作者采用兩次進樣,分別測試正離子模式與負離子模式,圖二C為正離子模式的TIC疊圖,圖二D為負離子模式TIC疊圖。


代謝組學

圖二 色譜分離基線的優化

03
方法驗證

為了驗證方法的可靠性,作者驗證了:

1. 加標回收率:向樣本中加入已知濃度的目標分析物,通過對未加標樣本與加標樣本的樣本處理后上機,用加標樣本的濃度減去樣本內源含量,與已知加標濃度比算出加標回收率,經過作者處理后加標回收率偏差的范圍是5.2 %-8.68 %;

2. 精密度:重復三次上機,計算濃度的相對標準偏差,精密度范圍是1.06 %-7.8 %;

3. 重復性:目標分析物分為低、中、高三個等級,濃度在四個數量級,每個濃度等級樣本在連續三天內重復進樣三次,計算每個濃度等級的相對標準偏差,作者對101個目標化合物進行測試,相對標準偏差低于15 %;

4. 日間精密度與日內精密度:通過評估一系列重復樣品的分析結果的密閉性來量化分析方法的日內和日間精密度,日內精密度0.6 %-10.5 %,日間精密度1.3 %-17.3 %。

04
方法適應性

為了驗證方法適應性,作者測試了擬南芥的根與莖受鹽脅迫與對照組中激素相關的轉錄物和代謝物水平,對已發表的微陣列數據集進行篩選,以確定一種刺激會影響涉及大多數植物激素代謝途徑的基因。圖三A為簡化版植物激素合成通路。作者設計的實驗是采用12 d的擬南芥幼苗在含有和不含有150 mm的NaCl媒介中培養48 h,分別采樣后按照樣品處理步驟處理后上機檢測,圖四A顯示整個過程的插圖,圖三B顯示鹽脅迫與對照組植物激素變化。

通過比較轉錄組數據,進一步交叉驗證了激素組結果(圖三C和D)和激素分布圖(圖四E和F)。這些發現表明,對刺激(如鹽度)的生理反應不是僅僅由一種激素的單一活性形式(甚至是幾種激素的單一活性形式)控制的,而是由多種激素、代謝物和基因的活性和比例組合控制的。作者通過的激素組分析和與轉錄組數據的交叉驗證強調了這種分析方法的價值,它提供了強有力的工具,不僅評估轉錄水平,而且能夠測定在樣本中相應代謝物的水平,從而獲得激素反應和相互作用的全局觀點。


代謝組學
圖三 鹽脅迫誘導擬南芥中植物激素相關基因表達水平的變化

代謝組學
圖四 鹽脅迫下擬南芥根和芽與對照植物激素的比較

05
小結

作者通過采用液相色譜串聯質譜的方式,使用Acquity UPLC CSH C18 RP column (150 × 2.1 mm,particle size of 1.7 μm)柱,對101種植物激素進行絕對定量檢測,通過驗證加標回收率、精密度、重復性等確保方法穩定可行,并通過研究鹽脅迫激素組分析與轉錄組數據交叉驗證,強調了方法的價值。

文章延伸

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代謝組學

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